Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Рентгеновская кристаллография и электронная микроскопия
Получение изображений молекул - разновидность структурного анализа

При рассмотрении образца в обычном световом микроскопе рассеянный объектом свет фокусируется объективом, благодаря чему формируется увеличенное изображение (рис. 20.1). При рассеянии от образца световых волн они претерпевают фазовые изменения, и линзы объектива, фокусируя их, сохраняют полученное после рассеяния соотношение фаз. Благодаря этому при рекомбинации лучей формируется изображение объекта (рис. 20.2). Разрешение, т. е. минимальный размер деталей, воспроизводимых в таком изображении, ограничен длиной волны используемого света (обычно ∼600 нм). Более мелкие детали могли бы быть видны в микроскоп, работающий, например на рентгеновском излучении с длиной волны 0,154 нм (CuKa-линия). К сожалению, линзы, способные фокусировать рентгеновские лучи, еще не созданы, и поэтому получить изображение в таких условиях нельзя. Можно лишь зарегистрировать интенсивности лучей, рассеянных изучаемым объектом, например, с помощью фотопластинки. Однако фазы этих лучей остаются неизвестными, и поэтому невозможно реконструировать изображение объекта.

РИС. 20.1. Схема светового микроскопа со стеклянными линзами, собирающими рассеянный образцом свет и реконструирующими увеличенное изображение объекта. Такая конструкция позволяет сохранить фазы рассеянных лучей в их исходном соотношении.

Объект, который до сих пор рассматривался, мог состоять из многих молекул, находящихся в различных ориентациях, например состояние молекул белка в растворе. Изображение такого образца воспроизвело бы каждую из молекул в ее конкретной ориентации. Собирая, однако, данные только об интенсивностях лучей, невозможно выделить лучи, рассеянные той или иной молекулой или окружающими их молекулами растворителя. Это можно сделать, используя кристаллические образцы, где все молекулы находятся в одинаковой ориентации (рис. 20.3). Благодаря регулярности кристалла лучи, рассеянные этими молекулами, концентрируются в отдельные дифракционные пики, что позволяет отделить излучение, рассеянное белковыми молекулами от фонового рассеивания, обусловленного, например, молекулами растворителя, и тем самым значительно повысить величину отношения полезного сигнала к шуму. Исследование кристаллических образцов может дать лишь усредненное изображение молекулы исследуемого вещества в кристаллической решетке, а не индивидуальное изображение какой-то конкретной молекулы, свободно плавающей в растворе. Дифракционная картина от кристалла (см., например, рис. 20.4) может быть зарегистрирована с помощью рентгеновской камеры подходящей конструкции. Дифракционная картина отражает трехмерное строение изучаемого кристалла. Поэтому полный набор данных об интенсивностях рассеянных лучей должен включить серию таких дифракционных картин, расположенных одна над другой и образующих так называемую обратную трехмерную дифракционную решетку. Расстояния между узлами такой решетки обратно пропорционально расстояниям между молекулами в кристалле. Интенсивности дифракционных максимумов, или пятен, содержат информацию о тонкой структуре молекулы. И если бы удалось определить относительные величины фаз волн в момент пересечения ими фотопластинки, то можно было бы рассчитать структуру молекулы и тем самым получить ее изображение. Однако определение фаз, или, как принято говорить, решение фазовой проблемы, является одной из наиболее трудоемких стадий рентгеноструктурного исследования.

РИС. 20.2. Две световые волны (а и б) с разными амплитудами и фазами и их сумма (в). Видно, что и амплитудная, и фазовая информации необходимы для суммирования.