Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Методы твердофазного анализа аминокислотной последовательности
Синтез смол
Определение содержания аминогрупп в носителях на основе органических полимеров или пористых стекол

Определив число аминогрупп, можно оценить изменение свойств носителя при храпении и провести сравнение свойств различных партий одного и того же носителя. См. также разд. 8.2.1.

12.3.3.1. Методики.

Методика 1 [33]. Аминогруппы носителя алкилируют тринитробензол-сульфокислотой. Гидролиз едким кали расщепляет связи Si—О стекла и превращает тринитрофенильные группы в пикриновую кислоту, содержание которой можно измерить фотометрически. Воспроизводимость метода — несколько процентов.

Смешивают в небольшой пробирке 50 мг 3-аминопропилстскла с 15 мг тринитробензолсульфокислоты в 1 мл 0,1 М NaBO₂ (pH 9,07). Перемешивают в течение 1,5 ч вращением пробирки в горизонтальной плоскости. Промывают водой (3 раза по 8 мл), центрифугируют. К влажному носителю прибавляют 1 мл 2 М КОН, перемешивают 60 мин при 45 °С. Разбавляют водой и измеряют поглощение при 358 нм. Рассчитывают содержание аминогрупп, учитывая, что в щелочной среде пикриновая кислота имеет ε₃₅₈ = 14 1 00. Для аминопропилстекла содержание аминогрупп обычно составляет 25—150 мкм/г носителя [29].

Методика 2 [18]. Набухший полимер реагирует с пикриновой кислотой, образующей соль с аминогруппами носителя. Полимер обрабатывают избытком сильного основания, переводя связанный пикрат в раствор, где и измеряют его содержание.

50 мг носителя замачивают в 1,2-дихлороэтане на 5 мин. Нейтрализуют 5%-ным (об./об.) раствором диизопропилэтиламином в дихлорометане в течение 3 мин. Обрабатывают 0,1 М пикриновой кислотой в дихлорометане (3 мин). Промывают носитель дихлорометаном (5 раз по 2 мл). Элюируют пикрат 5%-ным динзопропилэтиламином в дихлоро метане (2 порции по 3 мл), промывают смолу дихлорометаном (3 раза по 2 мл). Разбавляют раствор 95%-ным этанолом и измеряют поглощение. Для пикрата диизопропилэтиламина в диапазоне концентраций 1:20∙10^-5 моль/л (в этаноле, содержащем ≤20% дихлорометана) ε₃₅₈ = 14 500.

Методика 3 [56]. Аминогруппы носителя превращают в связанное основание Шиффа реакцией с 2-гидрокси-1-нафтальдегидом, которое затем переводят в раствор обработкой бензиламином. Концентрацию основания Шиффа в растворе определяют спектрофотометрически.

1—5 мг носителя смешивают с 2 мл 0,2 М 2-гидрокси-1-нафтальдегида в ДМФА и оставляют на 15 ч при комнатной температуре. Промывают смолу ДМФА (4 раза по 3 мл), затем этанолом до полного отсутствия поглощения при 270 нм в промывных фракциях. Добавляют 2 мл 0,4 М бензиламина в этаноле, выдерживают 45 мин при комнатной температуре. Центрифугируют, измеряют поглощение при 420 нм. Для основания Шиффа ε₄₂₃ =10 900 (в этаноле). Для твердофазных носителей емкость по связыванию определяется числом аминогрупп, приходящихся на единицу массы носителя и доступных для присоединения.