Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Применение масс-спектрометрии электронного удара для определения аминокислотной последовательности пептидов и белков
Особые случаи применения метода
Определение N-концевой аминокислотной последовательности

Обычно для определения N-концевой аминокислотной последовательности белка используют секвенатор. Однако в ряде случаев, например, когда N-конец белка заблокирован или когда необходимо определить N-концевую последовательность одновременно нескольких белковых субъединиц, нужная информация более успешно получается масс-спектрометрически. Для этого 50—100 нмоль белка растворяют в 200 мкл 98%-ной муравьиной кислоты и добавляют 100 мкл уксусного ангидрида. После 30 мин стояния при комнатной температуре раствор упаривают при пониженном давлении. Формилированный таким образом белок растворяют далее в 20 мМ растворе NH₄HCО₃ с pH 8,5 и гидролизуют химотрипсином или эластазой. Гидролизат лиофилизуют и перметилируют. При перметилировании пептиды со свободными N-концевыми аминогруппами образуют соответствующие четвертичные аммониевые соли, которые легко удаляются из реакционной смеси при промывании ее водой. После такого промывания в реакционной массе остается лишь пептид, формилированный по N-концевой аминогруппе. Описан

ным выше способом получают масс-спектр, на основании которого устанавливают аминокислотную последовательность N-концевого пептида. Ясно, что для успешного применения описанного метода необходимо, чтобы на определенном расстоянии от N- концевого аминокислотного остатка в белке имелись пептидные связи, расщепляемые указанными ферментами с образованием пептидов, изучение которых возможно методом масс-спектрометрии.