Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Новейшие методы твердофазного и жидкофазного определения аминокислотной последовательности
Автоматический жидкофазный анализ. Усовершенствованные методики
Анализ на микроуровне

Во многих случаях требуется проводить анализ малых количеств труднодоступного белка. Для снижения расхода анализируемого материала до 1—10 нмоль потребовалось значительное усовершенствование существующих методов. Например, модификация ЖФ-секвенатора включала создание системы стабильного высокого вакуума, разработку новых методик экстракции, использование специально сконструированных герметичных клапанов подачи реагентов с нулевыми мертвыми объемами, введение в схему прибора автоматического конвертора [108—110]. Эти усовершенствования были подхвачены и объединены с системой высокоэффективной очистки реагентов, растворителей и с использованием полибрена [47]. В последней работе, израсходовав всего 200 пмоль образца, удалось определить последовательность 47 остатков миоглобина кашалота; постадийные выходы составляли 95,5%. Для улучшения рабочих параметров ЖФ-секвенатора был сконструирован прибор новой конструкции [48] (см. также гл. 17). На этом приборе удалось определить протяженные последовательности, анализируя 20 пмоль белка или 200 пмоль пептидов. Попытки дальнейшего увеличения чувствительности с использованием всех вышеупомянутых методик большого успеха не имели, так как по-прежнему не решены проблемы вымывания образца в каждом цикле отщепления и загрязнения ФТГ-аминокислот примесями, образующимися в ходе процесса.

Использование высокочувствительных методик с применением радиоактивности помогло преодолеть часть этих проблем. Радиоактивная метка вводится либо в аминокислоты (биосинтетически), либо в реагенты, используемые для анализа последовательности. Белки, меченные биосинтетически in vivo или in vitro, должны быть очищены с помощью микрометодов; во многих случаях продукт, пригодный для анализа, можно получить при помощи иммунохимической очистки. В различных лабораториях анализировали радиоактивно меченные белки, расходуя 0,1—1,0 пмоль материала [79, 10З]. Единственным крупным недостатком этого метода является то, что не все белки можно метить in vivo или в культуре ткани из-за низкого их содержания и (или) малой скорости синтеза.

Примером использования радиоактивно меченных реагентов служит работа [54]. В каждом цикле отщепления белок обрабатывают сначала [³⁵S]ФИТЦ, затем «холодным» ФИТЦ. Этим методом удалось установить последовательность ~20 аминокислот, израсходовав 5—15 пмоль белка. В разд. 16.2.4.4 рассмотрено применение этого подхода в ТФ-анализе последовательности [17, 18]. Недостатком метода, как в случае ЖФ, так и в случае обычного ТФ-секвенатора, является большой расход реагента, необходимый для того, чтобы покрыть большую площадь поверхности реактора секвенатора. Это в свою очередь ведет к высокому уровню радиоактивного фона в анализе очень малых количеств образца и делает сам анализ и дорогим, и опасным.

В последнее время постоянно увеличивается применение ВЭЖХ в анализе последовательности аминокислот на микроуровне (гл. 6). Это позволяет выделить микрограммовые количества пептидов в виде растворов, пригодных для прямого нанесения в реактор секвенатора [112]. Важным дополнительным методом анализа коротких пептидов является масс-спектрометрия [12, 60, 73]; чрезвычайно высокая чувствительность этого метода может способствовать его широкому предпочтительному распространению.