Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Протеазы с низкой специфичностью
Термолизин

Термолизин выделяют из Bacillus thermoproteolyticus. Фермент находит чрезвычайно широкое применение в работах по определению аминокислотной последовательности белков. Термолизин выпускается в виде коммерческого препарата фирмой Calbiochem и некоторыми другими. Подробную информацию о применении этого фермента можно найти в работах [41, 65].

3.6.2.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. Фермент гидролизует N-концевые пептидные связи гидрофобных аминокислотных остатков типа -Х-Н-, где в большинстве случаев H = Val, Leu, Ile, Phe, Tyr или Trp. Однако специфичность этого фермента значительно шире, так как фермент гидролизует с достаточно высокой скоростью пептидные связи аланина. Довольно редко наблюдается гидролиз по остаткам Asn, Thr, His и Gly. Из множества работ, посвященных исследованию специфичности термолизина, особого внимания заслуживают работы [1, 41]. Фрагмент Pro-lie- чувствителен к действию фермента, а в последовательности типа -X-Phe-Pro-связь -X-Phe-устойчива. Гидролиз термолизином ингибируется соседними а-амино- или карбоксильными группами, следовательно, фермент не обладает экзопептидазной активностью. Амино- и карбоксильные группы боковых цепей аминокислотных остатков не оказывают заметного влияния на специфичность фермента.

Условия гидролиза. Термолизин проявляет активность в диапазоне pH 7,0—8,0, требует присутствия ионов Са²⁺. Гидролиз проводят в 100 мМ NH₄HCO₃, содержащем 5 мМ СаСl₂. Большинство препаратов фермента содержит значительное количество Са²⁺, которого в принципе достаточно для проявления ферментативной активности. Фермент ингибируется в присутствии ЭДТА. Обработка белков при 37 °С в течение 4 ч при соотношении фермент : субстрат=1 : 50 позволяет получить удовлетворительные результаты, хотя иногда требуется провести дополнительные исследования для подбора оптимальных условий. Термолизин термостабилен, сохраняет 100% активности при инкубации при 60 °С в течение 1 ч и значительную часть — при 80 °С [65]. Фермент устойчив в 8 М мочевине, а также в 20%-ном этаноле или метаноле, однако в этих условиях повышается вероятность термической денатурации фермента и вследствие этого гидролиз следует проводить при 20 °С.