Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
Газожидкостная хроматография аминокислот
Общая методика приготовления образцов
К гидролизату белка добавляют определенное количество внутреннего стандарта, обычно норлейцина, поскольку он хорошо разделяется со всеми другими аминокислотами, по применялись также пипеколиновая и транэксамовая кислоты и гомоаргинип. Некоторые биологические препараты требуют предварительной очистки.
Очистка биологических препаратов. Образцы плазмы (100—500 мкл) депротонизируют обработкой сульфосалициловой кислотой (50 мг/мл плазмы).
1) Пастеровскую пипетку (40X3 мм) заполняют на 10 мм смолой дауэкс-50W (8% поперечных сшивок, 200—400 меш, Н+-форма); сверху и снизу набивки помещают небольшие пробки из стеклянной ваты.
Добавляют к образцу известное количество внутреннего стандарта, подкисляют до pH I и наносят на колонку. Удаляют некатионные примеси промывкой 2 мл деионизованной воды. Аминокислоты элюируют 2 мл 4 М NH4OH со скоростью — 1 капля за 5—10 с. Элюат высушивают досуха [96].
2) Аминокислоты вновь растворяют в 0,1 М НСl и наносят на колонку (150X15 мм) с 7 мл катионообменной смолы амберлит CG-120 (Н+-форма, 100—120 меш). Промывают дважды 10 мл деионизованной воды. Элюируют аминокислоты 2X10 мл 7 М NH4OH, затем 5 мл деионизованной воды. Собирают элюат и высушивают досуха в вакууме на роторном испарителе при 60 °С [193].
8.17.1.1. Изобутиловые эфиры гептафторобутириламинокислот [231—233]. В большинстве случаев чувствительность пламенно-ионизационного детектора бывает достаточной для обнаружения этих производных. Для специальных целей использовались детекторы электронного захвата и термоионный, а также метод масс-спектрометрии [96, 230].
До и после этерификации следовые количества воды из образца могут быть удалены ацеотропной сушкой путем добавления метиленхлориди и упаривания. Для эффективного смешивания компонентов в процессе этерификации и ацилирования используют обработку ультразвуком или вибромешалки.
Приготовление спиртовых растворов HCl для этерификации. Спирт следует высушить над гранулированным сульфатом кальция (—50 г/л) или кипячением 3—4 ч над магниевой стружкой (с добавлением кристаллика иода, чтобы катализировать реакцию); после декантации кипятят еще 3—4 ч над гидридом кальция и перегоняют.
Необходимую молярную концентрацию НCl получают пропусканием сухого газообразного НСl в спирт до насыщения или до соответствующей массы, а затем после титрования щелочью разбавляют раствор до необходимого объема. Хранят в небольших склянках на холоду.
Когда требуется небольшое количество реагента для единичного образца, готовят его добавлением соответствующего количества ацетилхлориде к спирту на холоду (операция требует осторожности, поскольку реакция эндотермична) и доводят до нужного объема.
Этерификация. Образец смеси аминокислот (10—100 нмоль каждой аминокислоты) высушивают при 50 °С в сосуде типа Reactivial (фирма Pierce) в потоке сухого азота. Добавляют раствор 3 М НСl в изобутаноле (50—100 мкл) и выдерживают при 120 °С 30 мин. Через 5 мин после начала нагревания реакционную смесь встряхивают 20—30 с на вибраторе и продолжают нагревание. Охлаждают до комнатной температуры. Упаривают избыток реагента в потоке азота, это делается быстро, если сосуд нагрет до 50 °С. Следы воды могут быть удалены азеатропной сушкой с метиленхлоридом. Аналогичным образом были получены н-пропиловые эфиры аминокислот [118].
Ацилирование. Добавляют ангидрид гептафторомасляной кислоты (50 мкл) и нагревают при 150 °С 10 мин. После охлаждения до комнатной температуры образец высушивают досуха в потоке азота. Слишком длительное выдерживание в потоке азота может привести к потере некоторых летучих производных.
Растворяют остаток в сухом перегнанном ацетонитриле или этилацетате (50 или 100 мкл). Вводят 1—2 мкл на колонку ГЖХ. Если в смеси присутствует гистидин, образец растворяют в смеси этилацетата и уксусного ангидрида (1:1) и нагревают 3 мин при 150 °С; по охлаждении до комнатной температуры разбавляют этилацетатом. Реакцию лучше всего проводить в нагревательном блоке, лунки которого заполнены силиконовым маслом на высоту жидкости в реакционном сосуде, при этом его верхняя часть служит обратным холодильником.
Поскольку в реакционных сосудах возможны потери из-за негерметичности, предпочтительно использование трубок (50X3 мм) из стекла пирекс, их запаивают и вскрывают на каждой стадии процесса.
Рекомендуется проводить анализ на колонке как можно быстрее после окончания реакции ацилирования (не позднее чем через 2—3 ч), что особенно важно для сохранения производных цистеина, цистина, метионина, аргинина, гистидина.
Колонки. Хорошее разделение и количественное определение изобутиловых эфиров гептафторобутириламинокислот достигнуто несколькими группами исследователей. При этом были использованы различные типы колонок (описаны ниже), но порядок элюирования был одинаковым во всех случаях. Для улучшения разделения могут быть введены изменения в температурную программу. Скорость потока газа-носителя, температура узла ввода и детектора подбираются индивидуально для каждого прибора н исследуемой колонки.
1. Капиллярная стеклянная колонка (25 мх0,4 мм), покрытая смесью фаз 5% хромосорба +15% ОV-101. Газ-носитель — водород (3 мл/мин); газ-ускоритель — азот (30 мл/мин), водород (27 мл/мин), воздух (350 мл/мин). Температура колонки 90 °С, повышение по программе (4 град/мин). Порядок элюирования в течение 35 мин: Ala, Gly, Val, Tlir, Ser, Leu, Ile, Nie, Pro, Cys, пинеколиновая кислота, Hyp, Met, Asp, Phe, Glu, Lys, Tyr, Arg, KM-Cys, His, Ho mo Arg, Trp, Cys-Cys [57, 581.
2. Капиллярная колонка (25 мХ0,23 мм), покрытая стационарной фазой OV-101 (фирма LKB) |96|.
3. Стеклянная капиллярная колонка SCOT (60 мХ0,5 мм) со стационарной фазой SL-30 (фирма SGE) [289].
4. Стеклянная колонка (3,5 мХ2,5 мм), упакованная смолой Gas-Chrom Q (100—120 меш) с 3% фазы SE-30 (по массе) (Applied Science Laboratories) [2311.
5. Стеклянная колонка (3,1 мХ2 мм), упакованная хромосорбом WHP (100—120 меш) с 3% фазы SE-30 |232, 233].
6. Стеклянная колонка (3,5 мХ2 мм) с Gas-Chrom Q (80—100 меш) с 3% фазы SE-30 (фирма Supelko) [289|.
7. Стеклянная колонка (6 мХ2 мм), упакованная Gas-Chrom Q (80— 100 меш) с 3% фазы OV-I01 |339].