Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и полипептидных цепей
Получение мономеров с целью секвенирования
Гидролиз N-концевой пироглутаминовой кислоты
В идеальном случае при секвенировании по Эдману хорошо подготовленных образцов выход N-концевой аминокислоты должен быть количественным. Иными словами, образцы не должны содержать солей, каких-либо примесей, а N-концевая аминокислота должна быть свободна от защитных групп. В процессе очистки следует исключить возможность модификации функциональных групп аминокислот, поскольку автоматическое секвенирование возможно при условии максимального выхода на каждом цикле. Меры предосторожности, исключающие блокирование N-концевых аминокислот и образование гетерогенных препаратов, вкратце обсуждались в предыдущих разделах. В этот раздел включены специальные методики подготовки белков к анализу, в том числе способы делипидизации и отщепления олигосахаридных цепей у гликопротеинов с высоким содержанием углеводов.
Создание эффективного метода отщепления остатка пироглутаминовой кислоты решило проблему секвенирования белков, блокированных вследствие циклизации N-концевых Gln и Glu [136]. Поскольку благодаря «реакции деблокирования», протекающей с высоким выходом, становится доступной а-аминогруппа последующего аминокислотного остатка, реакцию циклизации следует рассматривать как удобный способ создания защитной группы на стадиях очистки белка. Снятие защиты осуществляют путем двукратной инкубации с пироглутаматаминопептидазой печени крупного рогатого скота. Метод был впервые использован при анализе легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, а затем при анализе тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа [181].
1.6.1.1. Отщепление N-концевого остатка пироглутаминовой кислоты [136]. Пироглутамат-аминопуптидазу печени крупного рогатого скота (L-нироглутамилпептид — гидролаза, КФ 3.4.11.8) хранят в лиофильно-высушенном состоянии при —20°С. Раствор (10 мл, 1 мг/мл) восстановленного и алкилированного белка диализуют при 4 °С против 0,1 М фосфатного буфера (pH 8), содержащего 5 мМ ДТТ+10мМ ЭДТА + 5%-ный (об.) глицерин. Затем препарат переносят в реакционную ампулу с герметически закрывающейся крышкой, добавляют 0,025 мг фермента, продувают азотом, плотно закрывают, перемешивают. Инкубацию проводят при 4 °С в течение 9 ч при периодическом перемешивании. Добавляют вторую порцию фермента (0,025 мг) и вновь инкубируют в атмосфере азота при 20 °С в течение 14 ч. Реакционную смесь диализуют против 0,05 М уксусной кислоты, высушивают лиофильно, образец белка секвенируют в автоматическом режиме.
Разработан метод гидролиза пироглутаминовой кислоты с образованием Ny-метилглутамина [125]. Защищенный пептид инкубируют в 17%-ном растворе метиламина при 37°С в течение 14 ч (или более). После дансилирования и последующего гидролиза идентифицируют ДНС-глутаминовую кислоту.