Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Методы твердофазного анализа аминокислотной последовательности
Методы присоединения
ДИТЦ-метод с использованием изотиоцианатного стекла
12.4.2.1. Преимущества, ограничения и методика присоединения
Преимущества.
1. Присоединение белков и пептидов к носителям на основе стекла характеризуется более высоким выходом, чем при использовании смол на основе полистирола.
2. Легче представляется обычная проблема растворимости пептида в буфере для конденсации. При плохом растворении пептида в обычном буфере перед добавлением носителя можно попробовать добавить пиридин и (или) ДМФА. При конденсации ДИТЦ-активированного пептида с носителем, содержащем аминогруппы, реагент имеет разную склонность к выпадению в осадок в виде производного мочевины в зависимости от содержания воды, необходимой для растворения пептида.
3. Метод является быстрым в исполнении.
Ограничения. Метод применим только к пептидам, имеющим остатки лизина или аминоэтилцистеина. Пептиды, имеющие эти аминокислоты внутри цепи, можно анализировать только до указанных остатков, являющихся точками присоединения. Метод нельзя рекомендовать для аргинилсодержащих пептидов.
Методика присоединения [40, 41, 42, 62, 72]. Соотношение пептид: носитель 1 нмоль на мг стекла. Растворяют под азотом 10—200 нмоль пептида или белка в 30—100 мкл буфера № 1. Проверяют pH, растворимость (разд. 12.4.5). Добавляют 10—100 мг ДИТЦ — АПС (в сухом виде) и перемешивают под азотом 60 мин при 30 °С. Добавляют 50—100 мкл этаноламина и перемешивают в тех же условиях. Интенсивно промывают реакционную массу ДМФА, метанолом и эфиром (каждым растворителем 2 раза по 2 мл). Жидкость над осадком контролируют на содержание пептида; носитель сушат в вакууме.
Модифицированная методика. Если пептид нерастворим в буфере на основе N-метилморфолина, то конденсацию можно проводить в одной из следующих систем: 50%-ный водный пиридин; ДМФА, внесенный после добавления триэтиламина (буфер № 3) или N-метилморфолина; бикарбонат натрия (pH 9,0; буфер № 4) с добавлением (при необходимости) 1% ДСН. Найдено, что при конденсации В-цепи инсулина в буфере N-метилморфолин — ТФУ, pH 9,0 выход составляет 45—50%, а в натрийбикарбонатном буфере (pH 9,0) — 66—70% [11].