Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Новейшие методы твердофазного и жидкофазного определения аминокислотной последовательности
Твердофазный анализ. Новейшие подходы
Общие замечания
Большие успехи в применении нерастворимых носителей для твердофазного (ТФ) синтеза пептидов [72] стимулировали разработку метода анализа аминокислотной последовательности пептидов, ковалентно присоединенных к нерастворимым полимерам [61]. Впоследствии метод ТФ-анализа структуры пептидов удалось автоматизировать [62]. Общая особенность методов синтеза («сборки») и анализа аминокислотной последовательности состоит в многократном повторении определенного набора химических реакций. Для получения высокого суммарного выхода в результате последовательного присоединения (или отщепления) многих аминокислот каждая отдельная реакция каждого цикла синтеза (или анализа) должна протекать с высоким выходом. Для смещения равновесия реакции используется избыток реагентов, поэтому в ходе процесса возникает задача отделения целевых промежуточных продуктов or избытка реагентов и побочных продуктов реакции. Проведение этого процесса в растворе требует больших затрат времени и реактивов. Разделение компонентов можно провести гораздо быстрее и экономичнее, используя принцип фильтрации или экстракции в гетерогенной системе жидкая фаза — твердая фаза. В настоящее время разработано много вариантов проведения высокоэффективных реакций в гетерогенных системах, в частности ТФ-анализ аминокислотной последовательности белков, широко применяемый и на практике дополняющий жидкофазный метод. ТФ-метод обладает следующими достоинствами:
1) реакционную массу можно тщательно промывать практически любыми растворителями без потери пептида;
2) для присоединения пептидов к носителю используется широкий набор реагентов и растворителей без ограничений по летучести или экстрагируемости, а использование больших избытков реагентов не вызывает больших осложнений при удалении последних;
3) постоянно образующиеся побочные продукты реакции непрерывно удаляются потоком проходящей жидкости, что сводит к минимуму их взаимодействие с пептидом или носителем;
4) можно проводить (до или после присоединения пептида или между отдельными стадиями ТФ-анализа) специфическое расщепление молекулы по внутренним остаткам пептидной цепи [43, 64, 65].
В данной главе не будут обсуждаться известные положения ТФ-подхода, поскольку основные его принципы читатель может найти в сборниках трудов первых четырех международных конференций, посвященных анализу структуры белка [13, 33, 63, 82] и в обзорах [65, 77], а также в данном сборнике (гл. 12).
Метод позволяет определять последовательность аминокислот, расходуя менее 10 нмоль образца. Для уверенной работы на уровне <1 нмоль необходимо коренное усовершенствование методологии, в том числе разработка высокочувствительной идентификации отщепляемых производных аминокислот. В этом отношении, в частности, очень велики возможности масс-спектрометрии. Следует отметить, что при повышении чувствительности детектирующих систем достоверность получаемой информации ограничена отношением величины сигнала к шуму, который определяется уровнем химического фона. В принципе ТФ-анализ позволяет получить чрезвычайно низкий уровень фона, но для этого следует пересмотреть многие аспекты химии процесса и конструкции прибора.
При работе с количеством образца <1 нмоль уровень фона может быть снижен прежде всего благодаря уменьшению навесок носителя (до нескольких миллиграммов и менее), а также путем миниатюризации всех элементов прибора (минимальная площадь загрязняющих поверхностей). Отдельные узлы и общая схема автоматических секвенаторов до сих пор основываются на старых идеях и включают многие комплектующие детали, которые использовались в установках для полуавтоматического анализа, что ограничивает возможности работы на микро- и ультрамикроуровне. В частности, для управления подачей реагентов лучше использовать не механические, а гидравлические устройства.
Наибольшее внимание следует уделять разработке химических аспектов метода; в этом отношении большие методические возможности и гибкость ТФ-анализа до сих пор мало используются. Для повышения чувствительности анализа необходимо добиваться снижения уровня химического фона и повышения эффективности отщепления аминокислот (выход как в первом цикле отщепления, так и постадийные выходы в последующих циклах). На основе более глубокого понимания всех проходящих химических реакций (как основных, так и побочных) необходимо систематически пересматривать условия проведения реакции Эдмана и разрабатывать другие методы отщепления.
В последующем обсуждении выражено лишь наше частное мнение относительно перспективности химических разработок в области методологии ТФ-анализа. При этом мы не предпринимали попыток всестороннего анализа появляющихся время от времени новых подходов.