Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
Ацетильная и формильная группы
Определение ацетильных и формильных групп
8.13.1.1. Метод газожидкостной хроматографии [59].
Приборы.
Газожидкостный хроматограф с детектором электронного захвата (или пламенно-ионизационным меньшей чувствительности).
Стеклянная капиллярная колонка (30 мХ0,27 мм, внутренний диаметр), покрытая смесью 5% хромосорб R+5% PP Seb (нанесенной по соответствующей методике) [55]. Прямой ввод образца (объем до 2 мкл) в капиллярную колонку без обогрева ввода [56J.
Реагенты
а-Бромо-2,3,4,5,6-пентафторотолуол (ПФБ-Вг) (фирма Aldrich),
15-краун-эфир (фирма Fluka),
Ацетонитрил (перегнанный над Р2О5).
Методика, >5 нмоль N-ацетилированного соединения гидролизуют в 20 мкл 0,1 М NaOH в полипропиленовой центрифужной пробирке объемом 0,5 мл в автоклаве при давлении в 1 атм (123 °С) в течение 3 ч. По окончании гидролиза вносят определенное количество (—5 нмоль) внутренних стандартов (н-масляная и изовалериановая кислоты) и приливают к смеси 20 мкл 1 М НВr и 2 мкл раствора 1 М NaHCО3. Отбирают аликвоты по 5 мкл и высушивают их в силанизированных стеклянных пробирках (50X30 мм) в потоке азота. К сухому остатку добавляют 10 мкл ацетонитрила, содержащего ПФБ-Вг (50 нмоль) и 15-краун-5-эфир (50 нмоль). Герметически закрывают пробирку и инкубируют при 80 °С 2 ч, регулярно встряхивая. Отбирают 1 мкл реакционной смеси, разбавляют 2 мл толуола. 1 мкл толуольного раствора наносят на колонку в изократическом режиме при 110 °С без обогрева ввода. Времена удерживания: ПФБ-Вr 6 мин, ПФБ-формиат 9 мин, ПФБ-ацетат 11 мин, ПФБ-пропионат 15 мин и нитробензол 18 мин (последний используется как внутренний стандарт).
Поскольку следовые количества уксусной и муравьиной кислот образуются в условиях реакции из реагентов, необходимо провести «глухой» опыт (в отсутствие исследуемого материала). Определяют также содержание ацетата в виде ПФБ-эфира в негидролизованном образце белка. Найденные величины и степень чистоты препарата белка ограничивают чувствительность метода (чувствительность обнаружения этих соединений с помощью детектора электронного захвата ~3 фмоль).