Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Основы генетической инженерии
Создание и анализ клонотек геномов

Генетическая инженерия как основа современной биотехнологии зароди­лась в семидесятые годы ХХ ст. в недрах молекулярной биологии. К этому времени были расшифрованы механизмы основных матричных процессов, происходящие в клетках прокариот — репликация, транскрипция и трансля­ция, кроме того, эти процессы были воспроизведены in vitro. Была определе­на структура генетического кода и синтезирован первый ген (аланиновой тРНК дрожжей). Удалось выделить и изучить свойства некоторых ферментов, использующих в качестве субстрата ДНК (рестриктазы, лигазы, ДНК-полимеразы). Эмбриологи освоили методологию пересадки ядер соматиче­ских клеток животных (лягушки) взамен удаленного гаплоидного ядра, что позволило воспроизводить животных неполовым путем, т. е. клонировать (получать генетически идентичные особи).

Так, впервые появилась надежда на возможность замены определенных генов (например, дефектных) в зародышевых клетках на другие — полноценные, иными словами, осуществления генной терапии. Однако для этого необходимо было освоить методологию выделения генов, их идентифи­кации, тиражирования, устойчивого культивирования в составе автономно реплицирующихся молекул, а также определения свойств продуктов этих ге­нов. Все эти вопросы решает генетическая инженерия, под которой подразу­мевают комплекс молекулярно-генетических методов, позволяющих осуще­ствить целенаправленное конструирование организмов путем манипуляций с их наследственным аппаратом.

Поскольку микроорганизмы, в частности бактерии, как одни из наиболее просто организованных форм живого, изучены гораздо лучше с генетической точки зрения, чем макроорганизмы, первые эксперименты по получению ре­комбинантных ДНК были осуществлены именно с бактериальными клетками. И вскоре обнаружилась еще одна важная перспектива использования дости­жений генетической инженерии, а именно конструирование высокопродук­тивных штаммов микроорганизмов—продуцентов биологически активных веществ, обладающих комплексом заданных свойств.

В данной главе охарактеризованы основные методы, позволяющие полу­чать определенные гены, вводить их в состав векторных молекул для клони­рования в клетках-реципиентах, идентифицировать гены в клонотеках, опре­делять последовательность нуклеотидов в ДНК. Знание данной методологии необходимо для современных биотехнологов, использующих для создания организмов — продуцентов нужных веществ достижения генетической инже­нерии.

Для конструирования организмов с заданными свойствами требуется иметь набор генов, детерминирующих желаемые функции (утилизация опре­деленных субстратов, биосинтез и секреция определенных продуктов, устой­чивость к определенным физическим и химическим факторам, деградация ксенобиотиков и т. п.). Такие гены можно выделить из любых организмов, обладающих соответствующими свойствами, но для этого вначале следует получить клонотеку генома данного организма и охарактеризовать ее. Под клонотекой генома понимают набор клонов бактерий или бактериофагов, ка­ждый из которых содержит один тип рекомбинантной ДНК, а в совокупно­сти — весь геном изучаемого организма, фрагменты которого распределены по отдельным клонам.