Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Основы генетической инженерии
Создание и анализ клонотек геномов
Получение генов

Используется три основных способа получения нужных генов: выделение из состава ДНК, химико-ферментативный синтез (in vitro), транскрипция изолированной из клетки матричной РНК с помощью обратной транскрипта­зы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы, ревертазы).

Выделение генов из ДНК. Большинство методик в генетической инжене­рии основано на вырезании из молекул ДНК определенных фрагментов и соединении их с другими фрагментами для получения рекомбинантных (химерных) ДНК. При этом фрагментация выделенной из клеток ДНК осу­ществляется с помощью ферментов, которые способны расщеплять ДНК в строго определенных сайтах. В качестве таких ферментов используются эн­донуклеазы рестрикции (рестриктазы), общая характеристика которых дана в главе 2. В генетической инженерии используются рестриктазы, образующие в ДНК однонитевые (липкие) концы (при разрезе уступом), а также те, что формируют в ДНК двухнитевые (тупые) концы (при расщеплении по сере­дине узнаваемого участка нуклеотидных пар). Примером рестриктазы перво­го типа, образующей липкие концы, является Eco RI (рис. 2.1), а рестриктазой второго типа является, например, Hind II.

Образование липких концов при расщеплении ДНК имеет преимущество, которое состоит в возможности реассоциации образованных фрагментов по гомополимерным липким концам (содержат комплементарные нуклеотиды). В таком случае появляется возможность формирования ассоциатов из фраг­ментов, принадлежащих разным молекулам ДНК, что и лежит в основе большинства генноинженерных манипуляций по получению рекомбинантных ДНК (рис. 20.1). Образующиеся спонтанно ассоциаты могут быть превраще­ны в целые молекулы путем «сшивания» с помощью ДНК-лигаз.

Следует указать, что в обычных условиях липкие концы в составе одной молекулы могут удерживаться друг относительно друга с помощью водород­ных связей между комплементарными основаниями. Однако комплементарные цепочки легко разделить при небольшом нагревании рас­творов ДНК (денатурация ДНК). При охлаждении липкие концы гибридизуются вновь за счет восстановления водородных связей при соблюдении принципа комплементарности (отжиг). В результате отжига набора фрагмен­тов, полученных при воздействии на разные молекулы ДНК одной и той же рестриктазой, могут образоваться как исходные молекулы ДНК, так и их гиб­риды — рекомбинантные ДНК.

Рис. 20.1. Схема образования рекомбинантных ДНК при расщеплении разных молекул ДНК рестриктазами, обнажающими во фрагментах липкие концы

В 1972 г. в Стэнфорде Дж. Мерц и Р. Дэвис осуществили первый подоб­ный эксперимент. Позднее оказалось, что не все геномы могут содержать сайты рестрикции для используемых рестриктаз. Особенно это касается не­больших молекул: плазмид и профагов, которые настолько малы, что содер­жат лишь по несколько сайтов рестрикции для небольшого числа рестриктаз. Данное обстоятельство существенно ограничивает возможности метода, по-этому была разработана методология введения в геном фрагментов ДНК, со­держащих необходимые сайты рестрикции.

Для этого используют искусственно синтезированные олигонуклеотидные ДНК с тупыми концами (линкеры). Линкеры синтезируют таким образом, чтобы в их составе содержались известные сайты рестрикции (предваритель­но требуется установить последовательность нуклеотидов в этих сайтах). ДНК для введения линкеров в ее состав расщепляют одной из рестриктаз, образующих тупые концы, а затем «сшивают» полученные фрагменты с лин­керами с помощью лигаз (рис. 20.2). Альтернативным методом получения тупых концов является механический разрыв крупных молекул ДНК при бы­стром перемешивании раствора или продавливании его через узкое отвер­стие. В результате этих манипуляций фрагменты ДНК приобретают сайты рестрикции внутри добавочных последовательностей (линкеров).

Теперь полученный фрагмент ДНК, содержащий требуемые сайты рест­рикции, можно присоединить к другой молекуле ДНК (например, к вектору), обработанной такой же рестриктазой, либо превратить в кольцевую форму путем сшивания взаимно комплементарных концов.

Описанные методы выделения генов в составе фрагментов ДНК с помо­щью рестрикционных ферментов широко распространены, но имеют ряд не­достатков. Во-первых, не всегда удается подобрать рестриктазы, позволяю­щие вырезать из ДНК именно тот участок, в котором содержится интересующий ген. Во-вторых, в составе вырезанного фрагмента ДНК могут оказаться затрудняющие дальнейшее использование гена последова­тельности, например интроны в эукариотических генах. В данном случае ре­комбинантные ДНК не смогут экспрессироваться в прокариотических клет­ках, поскольку последние не обладают способностью к сплайсингу (глава 3).

Рис. 20.2. Присоединение линкеров, содержащих сайты рестрикции (в данном случае для рестриктазы Eco RІ — обозначены стрелками), к фрагментам ДНК с тупыми концами

Химико-ферментативный синтез генов. С помощью этого метода син­тезированы, а впоследствии клонированы гены, определяющие структуру та­ких гормонов, как инсулин и соматостатин, а также лейкоцитарный интерфе­рон человека. Синтез гена интерферона осуществлен в СССР в 1984 г. под руководством академика М.Н. Колосова.

Суть метода сводится к следующему: in vitro осуществляют химический синтез коротких (8—16 нуклеотидов) одноцепочечных фрагментов ДНК, ко­торые затем соединяют с помощью лигаз и отжигают (дают возможность об­разоваться двухнитевым молекулам ДНК). Для этого метода необходимо знать последовательность нуклеотидов в гене, поскольку синтез осуществля­ется без матрицы. Ее устанавливают обычно исходя из аминокислотной по­следовательности соответствующего полипептида, однако из-за вырожденности генетического кода определить истинную нуклеотидную последователь­ность гена оказывается невозможным. Установить истинную структуру гена можно методом секвенирования ДНК, однако для этого требуется выделить и клонировать соответствующий ген.

Этап химического синтеза олигонуклеотидов в настоящее время полно­стью автоматизирован. Метод основан на специфической защите 5' или 3'-конца моно- или олигонуклеотида, предотвращающей его вступление в хими­ческие реакции. При необходимости блокирующие группы, с помощью кото­рых осуществляют модификацию, можно удалить обработкой кислотой либо щелочью. Цикл химического синтеза ДНК включает конденсацию нуклеоти­дов, удаление той или иной блокирующей группы и дальнейшую конденса­цию. Модификацией метода является прикрепление первого нуклеотида к твердому носителю и добавление следующих нуклеотидов по одному после промывки носителя на каждом таком этапе.

Воссоединение одноцепочечных фрагментов с помощью лигаз требует фосфорилирования 5'-концов, что осуществляется с использованием фермен­та полинуклеотидкиназы и АТР. Одноцепочечные ДНК можно превратить в двухцепочечные либо в процессе отжига с комплементарной антипараллель­ной цепью, также синтезированной химическим путем, либо при достройке комплементарной цепи ферментом (обычно используют ДНК-полимеразу I). При сочетании химического синтеза и ферментативных этапов, например, из 66 коротких синтетических фрагментов был воссоздан ген инсулина длиной 514 п. н.

Ферментативный синтез генов. Возможны два принципиально разли­чающихся способа ферментативного синтеза ДНК. Один из них не требует присутствия матрицы и осуществляется по программе, задаваемой экспери­ментатором. Такой синтез катализирует бактериальный фермент полинуклеотидфосфорилаза, специфичный в отношении рибонуклеотидов, но способный с меньшей скоростью и к полимеризации цепей ДНК. Для такого синтеза необходим праймер, включающий не менее 3 нуклеотидов. Реакции полимери­зации имеют некоторые ограничения и с трудом поддаются контролю.

Другой способ ферментативного синтеза ДНК предполагает участие мат­рицы, которой на первом этапе служит мРНК, выделенная из клетки. Практи­чески все мРНК эукариот имеют на 3'-конце «шлейф» (полиаденилатную по­следовательность). Этот участок используют для образования затравки для комплементарной цепи ДНК: к мРНК добавляют короткие последовательно­сти, состоящие из тимидилатов, которые в результате отжига гибридизуются с полиаденилатами (рис. 20.3). Обратная транскриптаза в присутствии набора дезоксирибонуклеотидов катализирует их присоединение к затравке в после­довательности, определяемой мРНК, в результате чего образуется двухнитевый гибрид РНК-ДНК. По невыясненным пока причинам новосинтезирован­ная цепь ДНК имеет на конце шпильку (рис. 20.3), которая возникает только при реакции in vitro (по-видимому, из-за того, что фермент «поворачивает вспять»). Эту шпильку используют в качестве затравки для синтеза второй цепи ДНК. На следующем этапе осуществляют деградацию РНК с помо­щью рибонуклеаз либо в ходе щелочного гидролиза, а оставшуюся однонитевую ДНК со шпилькой используют как матрицу для синтеза второй цепи ДНК (ДНК-полимераза 1). На заключительном этапе шпильку расщепляют с по­мощью нуклеазы S1, которая специфически гидролизует одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Так образуется двухцепочечная «комплемен­тарная» ДНК, или кДНК (в названии отражено основное ее отличие — комплементарность мРНК).

Рис. 20.3. Образование кДНК в ходе ферментативного синтеза на основе МРНК

Существуют модификации описанного метода, позволяющие избежать многих его недостатков, в частности синтеза неполных копий РНК (особенно в случае длинных мРНК). Одной из разновидностей метода является синтез кДНК непосредственно на векторе.