Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Основы генетической инженерии
Создание и анализ клонотек геномов
Введение гена в состав вектора

Полученный тем или иным способом ген может обусловить синтез соот­ветствующего продукта только в клетке, при условии, что он будет экспрес­сироваться. Кроме того, ген должен иметь возможность реплицироваться для того, чтобы все клетки в популяции имели его в своем составе и образовыва­ли необходимое количество продукта. Все эти условия (введение генов в клетки, их репликация, транскрипция и трансляция) обеспечиваются с помо­щью векторных ДНК (векторов).

Векторами называют небольшие автономно реплицирующиеся молекулы ДНК, в частности плазмиды, ДНК фагов или других вирусов, либо их моди­фикации, обеспечивающие проникновение в клетку и стабильное наследова­ние чужеродной ДНК (генов). Векторные репликоны должны отвечать ряду требований: содержать ori репликации и автономно реплицироваться; ста­бильно наследоваться клеткой-хозяином; содержаться в большом числе копий в клетке; обладать достаточной емкостью, позволяющей клонировать в их составе крупные гены; содержать «удобные» сайты рестрикции; содержать маркеры, по которым можно вести прямой отбор клеток, воспринявших кло­нированный сегмент ДНК и сам вектор; обладать широким кругом хозяев и др.

Поскольку плазмиды, как и вирусы, на основе которых конструируют век­торы для клонирования, неизбежно обладают специфичностью к видам орга­низмов, в которых способны реплицироваться, при создании векторов следует учитывать, в каких клетках-хозяевах будет осуществляться клонирование. Из большого количества систем вектор—хозяин, разработанных к настоящему времени, наибольшее распространение имеют те из них, где в роли хозяина выступают бактерии E. coli, а в роли вектора — плазмиды или фаги кишечной палочки. Следует отметить, что обеспокоенность ученых в отношении не­предсказуемых результатов клонирования эукариотических генов стимулиро­вала поиск и создание ослабленных штаммов бактерий-хозяев. В частности, были получены «безопасные» штаммы E.coli К 12, отличающиеся рядом осо­бенностей, исключающих «утечку» из лаборатории: потребность в особых факторах роста, отсутствующих в природных экологических нишах, хрупкая клеточная стенка, чувствительная к слабогипотоническим средам и др.

Плазмидные векторы. Для кишечной палочки создано большое количе­ство векторов на основе плазмидных репликонов, среди которых особенное распространение получили производные плазмиды ColEl, в частности pBR 322 (рис. 20.4). Этот вектор сконструирован при сочетании генетических методов in vivo и методологии рекомбинантной ДНК.

Плазмида pBR 322 имеет длину 4362 п. н., ее нуклеотидная последова­тельность полностью установлена. Вектор содержит гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину и тетрациклину, а также 12 единичных сайтов узнавания для рестриктаз (каждая из 12 рестриктаз может расщепить молекулу только в одном сайте).

Преимущества данного вектора состоят в следующем. Во-первых, он мо­жет присутствовать в клетках в большом числе копий на хромосому. Во-вторых, содержит два селективных маркера (устойчивость к ампициллину и тетрациклину), причем внутри генов, детерминирующих устойчивость к ан­тибиотикам, присутствуют сайты рестрикции для нескольких ферментов. Данное преимущество выражается в том, что если осуществлять встраивание чужеродного фрагмента ДНК в сайт, расположенный внутри гена устойчиво­сти, то ген инактивируется и клетки, наследующие плазмиду с клонирован­ным фрагментом ДНК, можно будет обнаружить по утрате устойчивости к тому или иному антибиотику. Например, если для встраивания фрагмента ДНК пользоваться рестриктазой Pst I, то нарушится целостность гена, ответ­ственного за устойчивость к ампициллину. Однако при этом сохранится ус­тойчивость к тетрациклину, и клетки, получившие такие векторы, можно бу­дет отобрать на среде с тетрациклином, а затем по чувствительности ко вто­рому антибиотику выявить те из них, которые содержат клонированный фрагмент.

Рис. 20.4. Карта плазмиды pBR322. Показаны: точка начала репликации (4362/1); гены устойчивости к ампициллину (Amp-r) и тетрациклину (Tet-r), а также сайты рестрикции для некоторых рестриктаз

Такой прием в генетической инженерии называется «инактивацией маркера в результате вставки».

Существуют и другие приемы отбора клеток, воспринявших векторы со встроенной ДНК. Один из них, например, заключается в способности N- концевой части ß-галактозидазы комплементировать определенную мутант­ную ß-галактозидазу бактериальной клетки. Поступают следующим образом. В вектор вводят часть lас-оперона E.coli, включающую промотор, оператор и 5'-кодирующую область гена lас Z (кодирует N-концевую часть ß-галактозидазы, рис. 3-5). В эту область встраивают полилинкер, который не нарушает ни кодирующую рамку, ни активность N-концевой части ß-галактозидазы. Полилинкер представляет собой искусственно синтезирован­ную последовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции для раз­ных нуклеаз. Если в полилинкере отсутствует вставка, такой векторный геном детерминирует синтез N-концевой части ß-галактозидазы, которая вместе с С-концевой частью, продуцируемой специальным штаммом E.coli, образует активную ß-галактозидазу. Этот фермент обеспечивает голубую окраску кле­ток на среде с хромогенным субстратом X_gal и индуктором. Если в состав по­лилинкера вводится чужеродная ДНК, нарушается комплементация и клетки, воспринявшие рекомбинантную ДНК, образуют неокрашенные колонии.

У векторов, сконструированных на основе плазмидных репликонов, есть отдельные недостатки, основной из которых заключается в снижении числа копий на клетку при увеличении размера гибридной плазмиды. В результате клонирование фрагментов ДНК, превышающих 10 т. п. н., становится мало­эффективным. Для клонирования таких крупных фрагментов ДНК использу­ют фаговые векторы, космиды и фазмиды.

Фаговые векторы. При использовании фаговых векторов жизнеспособ­ным продуктом, содержащим рекомбинантную ДНК, является не популяция клеток, как в случае с плазмидными векторами, а популяция фаговых частиц. Фаговые векторы более эффективны, чем плазмидные, при клонировании крупных вставок. Самыми распространенными для кишечной палочки явля­ются векторы, сконструированные на основе фагов 1 и М13.

Геном умеренного фага 1 представлен двухцепочечной ДНК размером 48,5 т. п. н., которая упакована в головку в виде линейной молекулы с однонитевыми комплементарными концами (липкие концы). После проникнове­ния в клетку липкие концы взаимно спариваются, молекула замыкается в кольцо и сшивается с помощью ДНК-лигазы. Места спаривания липких кон­цов получили название cos-сайтов, они принимают участие в образованиии фаговых геномов при репликации по типу катящегося кольца (глава 1). Про­фаг 1 в лизогенных клетках находится в интегрированном с нуклеоидом со­стоянии (механизм и особенности этого явления описаны в главе 2).

Важными для конструирования векторов являются некоторые особенно­сти генома фага 1. Во-первых, вся центральная часть (более 1/3 генома) не­существенна для литического цикла, а нужна только для установления лизо­генного состояния. Таким образом, ее можно заместить на чужеродную ДНК, и при этом фаг сохранит способность лизировать клетки. Во-вторых, для ус­пешной упаковки ДНК в головки фага требуется, чтобы ее длина была более 38 т. п. н., но менее 52 т. п. н.

В настоящее время сконструировано большое количество разнообразных векторов на основе фага 1. Типичные из них содержат сайты рестрикции для Eco RI, ограничивающие участок генома, не нужный для литического цикла (рис. 20.5). При воздействии рестриктазой Eco RI на ДНК такого вектора об­разуется 3 фрагмента, среди которых можно отобрать концевые (содержат гены, необходимые для литического цикла) благодаря их сравнительно боль­шим размерам. Эти фрагменты смешивают с чужеродной ДНК, обработанной Eco RI, и получают гибридные молекулы, у которых центральная часть пред­ставлена вставочным фрагментом (рис. 20.5). Затем полученные гибридные молекулы упаковывают в головки фага 1 in vitro. Для этого используют куль­туры клеток E.coli, инфицированные мутантными штаммами фага 1, один из которых имеет повреждение в гене, ответственном за процесс упаковки ДНК в головку, а второй — за синтез отдельных белков головки. Такие фаги не способны обусловить литический цикл, но обеспечивают накопление в клетках большо­го количества промежуточных продуктов, необходимых для сборки фаговых частиц: пустых головок, хвостовых отростков, ферментов, необходимых для сборки. Если экстракты таких клеток смешать с векторной ДНК, содержащей вставки определенной величины, произойдет их упаковка в головки фага и сформируются зрелые фаговые частицы. На следующем этапе этими части­цами инфицируют чувствительные клетки и получают потомство фагов с кло­нированными ДНК. В составе векторов на основе фага 1 можно клонировать фрагменты длиной до 15 т. п. н.

Рис. 20.5. Введение генов в состав векторов на основе фага λ

Еще одна категория фаговых векторов для E.coli базируется на геноме фага М13. Этот нитчатый «мужской» фаг (адсорбируется на F-пилях) содер­жит одноцепочечную ДНК. Когда фаговая ДНК проникает в клетки кишечной палочки, она реплицируется с образованием двухцепочечных («+»/«-») про­межуточных продуктов, «+»-цепи которых затем вновь упаковываются с об­разованием множества фаговых частиц. Двухцепочечный промежуточный продукт (репликативная форма, РФ) накапливается в клетках в числе 100— 200 копий. Его выделяют и используют как вектор для клонирования. Осо­бенностью фага М13 является то, что он не убивает клетки, а лишь замедляет их деление. Частицы фага непрерывно выделяются в культуральную жид­кость, и их титр может достигать 10¹² в мл. При этом на газоне чувствитель­ных бактерий фаг выявляется в виде мутных бляшек.

В состав ДНК фага для удобства введения чужеродной ДНК включают полилинкеры. Когда в РФ ДНК М13 встраивается гетерологичная последова­тельность, в фаговые частицы упаковывается только одна из цепей этой вставки (рис. 20.6). Одноцепочечные молекулы ДНК не применяют для конст­руирования векторов, поскольку их нельзя разрезать с помощью обычно ис­пользуемых рестриктаз. Клонируя фрагмент в М13 в обеих ориентациях, мож­но получить большие количества каждой из цепей.

Для удобства отбора рекомбинантных форм (фагов, в геном которых про­изошла вставка чужеродной ДНК) используют вставки в некодирующую об­ласть вектора части lac-оперона E.coli, которая обусловливает комплемента­цию мутантной ß-галактозидазы, и полилинкер. Когда в полилинкере отсут­ствует вставка, фаговые частицы на специальном мутантном штамме кишеч­ной палочки в присутствии индуктора и хромогенного субстрата образуют голубые негативные колонии. Встраивание фрагмента ДНК в вектор в облас­ти полилинкера нарушает комплементацию, и бляшки остаются неокрашен­ными.

Преимуществом фаговых векторов на основе М13 является способность включать очень большие вставки, поскольку в данном случае процесс упа­ковки ДНК не зависит от размера фагового генома. Самое важное примене­ние векторов-производных фага М13 состоит в получении одноцепочечных ДНК-матриц для секвенирования методом Сэнгера. Кроме того, однонитевые ДНК являются идеальной мишенью для сайт-специфического мутагенеза.

Анализ изложенного выше позволяет обнаружить у плазмидных и фаго­вых векторов свои преимущества, что послужило поводом для конструирова­ния векторов, объединяющих свойства одних и других. Это группа так называемых плазмидно-фаговых векторов, которая включает космиды и фазмиды.

Рис. 20.6. Встраивание фрагментов ДНК в векторы на основе фага М13

Космиды. Представляют собой один из типов гибридных векторов, кото­рые реплицируются, используя плазмидный тип репликации, но обладают способностью упаковываться in vitro в капсиды фага λ. Иными словами, кос­миды представляют собой плазмиды, содержащие cos-участок (липкие кон­цы) ДНК фага λ. Благодаря cos-сайтам эти векторы могут быть введены в клетку не с помощью трансформации, а путем обычной инфекции, в резуль­тате чего эффективность получения рекомбинантных клеток возрастает в 100 и более раз. В космидных векторах можно клонировать фрагменты ДНК раз­мером 33—49 т. п. н., таким образом, эти векторы предназначены для встраивания крупных эукариотических генов, что имеет особое значение для создания клонотек эукариотических геномов.

Примером космидного вектора служит плазмида pBR322, у которой в составе гена устойчивости к ампициллину клонированы cos-сайты фага λ. Если такой вектор расщепить рестриктазой и смешать с фрагментами чужеродной ДНК, полученными при воздействии на геном тем же рестриктирующим ферментом, может образоваться смесь конкатемеров.

Конкатемеры представляют собой длинные молекулы, в которых геномы фага λ (или замещающая их ДНК) повторяются несколько раз и отделены друг от друга cos-сайтами (рис. 20.7). При смешивании этих конкатемеров с белками, осуществляющими упаковку ДНК фага λ, они разрезаются по cos- сайтам и ДНК включается в состав капсида. Чтобы это произошло, расстоя­ние между двумя соседними cos-сайтами должно составлять 38—52 т. п. н.

Как и в случае с 1-векторами, смесь конкатемеров может включать век­торные молекулы без вставок, а также с множеством повторяющихся вставок. После инфицирования клеток рекомбинантная ДНК поддерживается в них в виде плазмиды, детерминируя в данном случае устойчивость к тетрациклину.

Рис. 20.7. Использование космидных векторов для клонирования

Фазмиды. Это тоже гибридные векторы, способные развиваться и как фаг, и как плазмида, поскольку содержат в составе все гены, необходимые для литического цикла, а также гены, нужные для репликации плазмиды. Ем­кость фазмид меньше, чем космид, и сопоставима с таковой для фаговых век­торов. Преимуществом фазмид является то, что размер их ДНК слишком мал, чтобы мономер мог упаковаться в капсид фага λ, в то же время слишком ве­лик, чтобы произошла упаковка димера вектора. Поэтому негативные коло­нии способны формировать только рекомбинантные фазмиды, поскольку их размеры соответствуют емкости головки фага λ.

Вставка в фазмиду чужеродного фрагмента ДНК осуществляется подобно уже описанным примерам для других векторов, чаще — по сайтам рестрик­ции. После этого гибридные фазмиды упаковывают в капсиды in vitro, как описано выше. При инфицировании чувствительных клеток фазмиды обу­словливают литический цикл и формируют бляшки на газоне тест-культуры. Однако если вектор содержит ген d, кодирующий структуру белка-репрессора, то фазмида реплицируется как плазмида, а не как фаг. Часто в составе фазмид используют мутантные гены d, определяющие структуру температурочувствительного белка-репрессора, который инактивируется при повышенной температуре. В этом случае фазмида ведет себя как плазмида при низкой температуре, а при повышении температуры на несколько градусов индуцируется к литическому циклу. Такое свойство фазмид во многих случаях оказывается очень полезным.

Свойствами фазмид обладают некоторые бактериофаги, например фаг Р1, который в состоянии профага не интегрирует в хромосому, а поддерживается в виде плазмиды. Мутант фага Рlclr100 способен индуцироваться к литиче­скому циклу при температуре выше 32° С, т. е. ведет себя как типичная фазмида.

Выше охарактеризованы типы векторов, используемых для клонирования генов в клетках E.coli. Для других видов прокариот также сконструировано множество различных векторных молекул, среди которых обращают на себя внимание так называемые «челночные векторы». Их особенность состоит в способности к репликации в разных клетках-хозяевах, что обеспечивается введением в вектор дополнительных областей начала репликации (ori), а также генов, требуемых для репликации и не поставляемых хозяйскими клет­ками. Одни из челночных векторов способны поддерживаться в клетках раз­ных прокариот, другие — в клетках некоторых прокариот и эукариот (дрож­жей, растений, животных). Использование челночных векторов составляет определенное удобство для клонирования генов и анализа их продуктов, по­скольку одни и те же гены получают возможность реплицироваться и экс­прессироваться в разных организмах.

Одним из примеров конструирования челночных векторов является объе­динение части 2 мкм (двухмикронной) плазмиды дрожжей Saccharomyces cerevisiae с плазмидой pBR322, содержащей дрожжевой ген HIS3 (кодирует один из ферментов биосинтеза гистидина). Оказалось, что ген HIS3 экспрес­сируется и в бактериальных клетках благодаря тому, что содержит область, гомологичную соответствующему промотору E.coli. Такой вектор реплициру­ется в клетках дрожжей S. cerevisiae и в бактериях E.coli и позволяет осуществлять прямой отбор воспринявших его клеток при использовании гистидин-зависимых штаммов на синтетической среде без этой аминокислоты.

Основой векторов для клонирования генов животных чаще всего является геном вируса обезьян SV40. Общие принципы конструирования векторов в этом случае такие же, как для векторов на основе фага λ.

Для растительных клеток, которые не содержат собственных плазмид, ос­новой векторов часто служат геномы вирусов растений, а также бактериаль­ная плазмида pTi, которая опосредует перенос сегментов плазмидной ДНК в геномы различных двудольных растений и индуцирует образование опухолей (корончатых галлов). Семейство плазмид pTi выявлено в грамотрицательных бактериях Agrobacterium tumefaciens.