Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Основы генетической инженерии
Создание и анализ клонотек геномов
Стратегия клонирования генов

Термин «клонирование» происходит от слова «клон», под которым подра­зумевается генетически однородное потомство клеток или вирусов, т. е. полу­ченных при неполовом размножении. Простейшим примером клона является изолированная колония бактерий на плотной среде. Когда говорят о клониро­вании гена, имеют в виду тиражирование копии гена в составе векторной мо­лекулы в клетках клона (или вирусных частицах в составе бляшки). При этом каждая клетка клона (каждая вирусная частица в пределах изолированной негативной колонии) будут содержать одинаковые фрагменты чужеродной ДНК. Это очень важный методологический прием, составляющий основу всей генетической инженерии. Ведь при получении генов в ходе расщепления ДНК какого-то организма и включении полученных фрагментов в состав век­торов формируется очень сложная смесь молекул, в которой один ген или его сегмент составляет ничтожную часть, так что невозможно изучить ни его структуру, ни свойства продукта. Однако при введении рекомбинантных ДНК (вектор со вставкой) в клетки или вирусные частицы возможность к репро­дукции в каждой клетке (вирусной частице) приобретает только один тип гибридной ДНК. Выделив клон или содержимое бляшки, можно их инкуби­ровать и получать неограниченное количество клонированных генов, а также их продуктов.

В предыдущем разделе уже описано несколько схем клонирования фраг­ментов ДНК в составе разных векторов (рис. 20.5—20.7). Обобщая этот ма­териал, следует отметить, что для клонирования генов используют самые разнообразные системы вектор-хозяин. При этом наибольшее распростране­ние получили системы, в которых реципиентными клетками служат бактерии E.coli. Рекомбинантные ДНК вводят в клетки-хозяева или вирусные частицы различными способами.

Для введения в клетки векторов, сконструированных на основе плазмид, используют метод трансформации компетентных клеток или более эффектив­ный способ — трансформацию протопластов (глава 2). Однако такой способ переноса генетической информации характеризуется невысокой частотой (в трансформации участвует ~1 из 500—10 000 молекул ДНК), поэтому для от­бора клеток, воспринявших вектор, требуется наличие в его составе специ­альных маркеров. В качестве таких маркеров чаще всего используют гены устойчивости к антибиотикам, позволяющие производить прямую селекцию трансформированных бактерий на среде с соответствующим антибиотиком.

Векторы, сконструированные на основе вирусов, а также космиды и фазмиды имеют преимущества перед плазмидными векторами в том, что их с высокой эффективностью удается упаковывать в вирусные капсиды in vitro, а затем инфицировать чувствительные клетки. Метод инфекции намного эф­фективнее трансформации: инфекционной становится каждая десятая моле­кула ДНК. При этом космиды и фазмиды, попав в клетки, способны поддер­живаться в них по типу плазмидной ДНК.

Еще одна задача в процедуре клонирования состоит в отборе клонов, вос­принявших именно рекомбинантную ДНК, а не просто векторные молекулы, которые обязательно присутствуют в смеси, полученной при включении фрагментов ДНК в состав векторов. Для решения этой проблемы используют уже описанные приемы, например, инактивацию маркера в процессе вставки. Более прогрессивным способом отбора клонов бактерий или фагов, содержа­щих векторы со вставками, служит комплементационный анализ с использо­ванием мутантных генов ß-галактозидазы (см. выше). Применение этого ме­тода позволяет отличать клоны бактерий (бляшки фагов), содержащие реком­бинантную ДНК, по цвету при высеве на среду определенного состава. Еще одним подобным примером служит использование гена mel для конструиро­вания плазмидных векторов. Этот ген определяет структуру фермента тирозиназы, катализирующей превращение тирозина в меланин (темная окраска колоний). При вставках фрагментов ДНК в кодирующую область гена mel происходит его инактивация, и трансформированные колонии утрачивают окраску. Существуют и другие приемы для быстрого поиска среди трансфор­мированных или инфицированных клонов тех из них, которые восприняли рекомбинантную ДНК.