Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Основы генетической инженерии
Практическое использование методов генетической инженерии
Локализованный мутагенез и белковая инженерия

Методы генетической инженерии, в частности клонирование индивиду­альных генов или их частей, а также секвенирование ДНК, позволили значи­тельно усовершенствовать методологию мутагенеза, устранив основные не­достатки классических способов индукции мутаций в геномах. Классический генетический анализ предполагает воздействие мутагенного фактора in vivo на целый геном, в результате чего в нем возникают случайные мутации, за­частую множественные, что сильно осложняет идентификацию мутантов. Выявление мутантных особей осуществляют по измененным фенотипическим признакам, а природу мутации можно определить после секвенирования ДНК. Современный локализованный мутагенез, по сути, предполагает обрат­ные действия: вначале клонируют интересующий ген или его сегмент, опре­деляют его структуру в ходе секвенирования, а потом in vitro вносят требуе­мые изменения в его состав. Последствия вызванной мутации определяют после введения мутантного гена в исходный организм.

Самый простой вариант локализованного мутагенеза состоит в обработке клонированного фрагмента ДНК одним из мутагенных факторов, однако ре­зультатом такого воздействия будут тоже случайные изменения в структуре фрагмента. Более надежные и чаще применяемые методы локализованного мутагенеза осуществляются без использования мутагенных факторов. Среди типов мутаций преобладают делеции, вставки и замены нуклеотидов.

Делеции. Эти типы мутаций при локализованном мутагенезе получают с помощью эндонуклеаз. Используют как рестриктирующие, так и неспецифи­ческие эндонуклеазы. Наиболее простой случай использования рестриктаз состоит в расщеплении какого-либо генома с помощью рестриктазы, внося­щей несколько разрывов с образованием липких концов. Полученные фраг­менты вновь замыкают в кольцо с помощью ДНК-лигазы, что может привести к образованию молекул, не содержащих один из сегментов ДНК. При та­ком подходе формируются протяженные делеции, и его используют, как пра­вило, в предварительных экспериментах, чтобы определить функции относи­тельно больших участков клонированной ДНК.

Небольшие делеции получают следующим образом. Клонированный фрагмент расщепляют в составе вектора в подходящем сайте с помощью рестриктазы (рис. 21.1). Образовавшуюся линейную молекулу обрабатывают экзонуклеазой III, которая гидролизует в составе ДНК одну цепь, начиная с 3'-конца. В результате получается набор молекул с одноцепочеч­ными 5'-хвостами разной протяженности. Эти хвосты гидролизуют нуклеазой S1, специфичной к одноцепочечной ДНК, и в ДНК формируются делеции. Можно также применять экзонуклеазу Bal 31, которая катализирует деграда­цию обеих цепей, начиная с концов линейных молекул ДНК. Ход нуклеотических реакций регулируют, варьируя время инкубации, температуру и концентрацию фермента, индуцируя образование делеций разной длины. Получен­ные делеционные варианты линейных ДНК часто перед циклизацией снаб­жают линкерами, чтобы в районе делеции присутствовали рестрикционные сайты. Существуют и другие модификации описанных методов.

Рис. 21.1. Получение делеций в клонированных фрагментах ДНК с помощью рестрикционных ферментов. Темным цветом выделена чу­жеродная ДНК, светлым — ДНК вектора

Вставки (инсерции). Для получения инсерций клонированную ДНК расщепляют рестриктазой или неспецифической эндонуклеазой, а затем ли­гируют образующиеся фрагменты в присутствии сегмента, который хотят вставить в ДНК. Чаще всего в качестве таких сегментов используют синтези­рованные химическим путем полилинкеры (глава 20).

Инсерции, как и делеции, способны нарушить целостность гена или структуру его регуляторных областей, в результате чего будет синтезировать­ся дефектный белок (в случае протяженных делеций или сдвига рамки считы­вания, как правило, неактивный) либо будут наблюдаться изменения процес­са транскрипции интересующего гена. Таким способом чаще получают регу­ляторные мутанты и конструируют экспрессируемые векторы (глава 20).

Точечные мутации. Эти мутации представляют собой замену нуклеоти­дов. Для их получения можно использовать несколько подходов: дезаминиро­вание цитозина, включение аналогов нуклеотидов, неправильное включение нуклеотидов при репарации пробела и др.

Первый способ основан на том, что остатки цитозина в одноцепочечной ДНК можно дезаминировать с образованием урацила с помощью обработки ионами бисульфита. Одноцепочечные участки в ДНК получают обычно вбли­зи сайтов рестрикции, например, при действии экзонуклеазы III. После обра­ботки бисульфитом одноцепочечные бреши застраивают с помощью ДНК-полимеразы и лигируют концы. В сайтах, где вместо цитидилата при дезами­нировании образовался уридилат, комплементарное положение займет аденилат, а при репликации такой молекулы произойдет замена пары GС на пару AT.

Другой подход при индукции замен состоит в обработке клонированной ДНК какой-либо рестриктазой в присутствии бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарушения в струк­туру дуплекса. В результате образуется только однонитевый разрыв ДНК. В месте однонитевого разрыва создают небольшой пробел, а затем застраивают его в присутствии ДНК-полимеразы, dATP, dGTP, dCTP и N-4-гидроксицитозинтрифосфата вместо dTTP. Гидроксицитозинтрифосфат включается в цепь вместо тимидилата, но при репликации ДНК спаривается одинаково хорошо и с аденилатом, и с гуанилатом. В результате включения гуанилата после дополнительного раунда репликации в данном сайте про­изойдет замена АТ→GC (рис. 21.2). Поскольку в данном методе замена нуклеотидов осуществляется внутри сайта рестрикции, появляется возможность легко различить векторы с исход­ной последовательностью и мутантные. Для этого достаточно обработать их используемой в эксперименте рестриктазой: мутантные молекулы не под­вергнутся расщеплению.

Рис. 21.2. Получение замен нуклеотидов в процессе ло­кализованного мутагенеза

Похожий метод основан на использовании только трех из четырех воз­можных нуклеотидов при заполнении однонитевой бреши ДНК-полимеразой. В большинстве случаев фермент останавливается в том месте молекулы, где встречается комплементарный отсутствующему нуклеотид. Однако изредка ДНК-полимераза ошибается и включает один из трех присутствующих нук­леотидов. Это приводит к образованию кольцевых молекул, в составе кото­рых присутствуют неспаренные некомплементарные азотистые основания. При введении таких векторов в клетки бактерий в части молекул произойдет репарация такого повреждения. В результате в половине молекул после реп­ликации восстановится исходная последовательность, а в другой половине закрепится мутация. Отличить мутантные молекулы можно описанным выше способом.

Сайт-специфический мутагенез. Охарактеризованные методы локали­зованного мутагенеза отличаются тем, что сайты, где происходят мутации, выбираются случайно. В то же время техника сайт-специфического мутаге­неза позволяет вводить мутации в точно определенный участок гена. Это осуществляется с использованием синтетических (полученных химическим синтезом) олигонуклеотидов с заданной последовательностью. Метод удобен тем, что не требует присутствия удобных сайтов рестрикции. В основу метода положено образование гетеродуплексов между синтетическим олигонуклео­тидом, содержащим мутацию, и комплементарной однонитевой ДНК в соста­ве вектора.

Поступают следующим образом. Синтезируют небольшой олигонуклеотид (8—20 мономеров), комплементарный той части гена, в которой хотят полу­чить мутацию. В составе олигонуклеотида в центральной области допускают одну или несколько нуклеотидных замен. Клонируют исследуемый ген или его фрагмент в составе вектора на основе фага М13, чтобы получить кольце­вые одноцепочечные рекомбинатные ДНК. Производят смешивание и отжиг рекомбинантных векторов с олигонуклеотидами. Происходит гибридизация олигонуклеотида с комплементарной областью, при этом некомплементарные нуклеотиды остаются неспаренными. Олигонуклеотид выполняет роль прай­мера в полимеразной реакции с участием ДНК-полимеразы in vitro. Кольцо замыкают лигазами. Полученная кольцевая молекула вводится в клетки E.coli, где происходит частичная репарация мутантных участков и реплика­ция. Частота мутаций обычно варьирует от 1 до 50%. Отбор клеток, содер­жащих мутантные молекулы ДНК, можно производить несколькими спосо­бами, среди которых преимущества имеет метод с использованием радиоак­тивно меченного олигонуклеотида, который применяется для мутагенеза. В данном случае этот нуклеотид служит зондом. Принцип использования такого зонда основан на том, что он полностью комплементарен мутантной ДНК и частично комплементарен ДНК дикого типа. Можно подобрать такие условия гибридизации (в первую очередь, температуру), что гибридизация меченого зонда будет стабильной только с мутантной последовательностью ДНК, что можно выявить на радиоавтографе.

Метод сайт-специфического мутагенеза особенно ценен тем, что позволя­ет изолировать мутации без контроля их фенотипического проявления. Этот метод открывает новые возможности исследования функций регуляторных элементов генов, позволяет изменять «силу» промоторов, оптимизировать сайты связывания с рибосомами и т. д. Одним из основных применений дан­ной методологии является белковая инженерия.

Белковая инженерия. Этим словосочетанием обозначают комплекс ме­тодических приемов, которые позволяют реконструировать молекулу белка путем направленного введения соответствующих мутаций в структурный ген (сайт-специфический мутагенез) и, следовательно, желаемых аминокислот­ных замен в первичную структуру белка.

Показательным примером конструирования более активных белков явля­ются эксперименты Фершта и сотрудников с ферментом тирозил-тРНК-синтетазой из бактерий Bacillus stearothermophilus. Анализ последствий за­мен аминокислот в активном центре этого фермента позволил заключить, что удаление групп, образующих с субстратом слабые водородные связи, может улучшить его сродство к субстрату. При этом обнаружено, что треонин-51 (занимает 51 положение в составе пептида) образует длинную и слабую водо­родную связь с кислородом кольца рибозы при связывании тирозиладенилата. В то же время обнаружено, что у бактерий E. coli такое же положение занимает пролин. Сайт-специфический мутагенез гена, определяющего струк­туру тирозил-тРНК-синтетазы B.stearothermophilus, позволил обеспечить за­мену thr-51→pro-51 в пептиде. В результате резко улучшилось связывание АТР в активном центре фермента, а его каталитическая активность возросла в 25 раз.

Другим, не менее значимым примером реконструкции белка, имеющим практическое значение, является модификация субтилизина из Bacillus amyloliquefaciens, осуществленная Эстеллом и соавторами. Субтилизины представ­ляют собой сериновые протеиназы, секретируемые бациллами во внешнюю среду. Эти ферменты выпускаются биотехнологической промышленностью в больших масштабах и широко используются в составе моющих средств. Не­достатком субтилизинов является резкое уменьшение протеолитической ак­тивности под действием окислителей, в том числе содержащихся в стираль­ных порошках. Задача реконструкции молекулы субтилизина BPN заключа­лась в стабилизации его к химическому окислению.

В предварительных экспериментах было установлено, что в присутствии перекиси водорода субтилизин быстро снижает активность за счет окисления остатка метионина-222, превращающегося в соответствующий сульфоксид. Методами сайт-специфического мутагенеза была обеспечена замена этого остатка метионина на все остальные 19 белковых аминокислот. Плазмиды с мутантными генами вводили в штаммы с делециями в соответствующих ге­нах и анализировали свойства продуцируемых субтилизинов. Достаточно стабильными к действию перекиси оказались мутанты с серином и аланином-222. Самым активным оказался мутант, содержащий остаток цистеина-222, его удельная активность на 38% превышала активность штамма дикого типа.

Аналогичным путем удалось повысить активность ß-интерферона. В чис­ле других достижений белковой инженерии можно назвать исследования в выяснении трансформирующей активности онкобелков; изменение термоста­бильности ферментов, например получение термолабильного ренина и термо­стабильной a-амилазы; увеличение эффективности связывания инсулина со­ответствующим рецептором плазматической мембраны за счет замены гисти­дина на аспартат в положении 10 ß-цепи гормона, а также множество других примеров. Большое количество продуктов белковой инженерии уже нашло практическое применение в производственных процессах.