Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Основы генетической инженерии
Практическое использование методов генетической инженерии
Достижения генетической инженерии в конструировании штаммов-продуцентов биологически активных веществ

Если изначально методология генетической инженерии разрабатывалась для исследования основных механизмов экспрессии генов, а также функций их продуктов, то очень скоро выявились разносторонние прикладные аспекты ее достижений. В числе самых первых генноинженерных триумфальных экс­периментов было получение штаммов бактерий, продуцирующих человече­ские белки (инсулин, гормон роста, интерфероны и др.). Можно сказать, что эти исследования открыли эру широкого использования продуктов генетиче­ской инженерии. Поскольку данные эксперименты весьма показательны и дают возможность осознать практическую значимость большей части описанных выше приемов получения и анализа рекомбинантных ДНК, имеет смысл рассмотреть их в данном разделе.

Получение бактерий-продуцентов человеческого инсулина. Инсулин представляет собой гормон, секретируемый клетками поджелудочной железы в кровь и участвующий в углеводном обмене. Процесс синтеза инсулина в клетках осуществляется в ходе нескольких стадий: вначале на рибосомах об­разуется препроинсулин, который содержит сигнальный пептид, направляю­щий пептидную цепь внутрь эндоплазматического ретикулума. Там отщепля­ется сигнальный пептид и замыкаются дисульфидные мостики — формируется проинсулин. Последний поступает в аппарат Гольджи и депо­нируется в клеточных везикулах, где в ходе отщепления С-пептида (33 ами­нокислотных остатка) образуется зрелый инсулин. Молекулы зрелого инсули­на состоят из А- и В-цепей, соединенных дисульфидными мостиками.

Чистый инсулин необходим в большом количестве для лечения диабета. До недавнего времени гормон приходилось получать дорогостоящим и трудо­емким способом из поджелудочной железы животных. Этот инсулин вызывал ответную реакцию — образование антител. В настоящее время инсулин чело­века получают с помощью сверхсинтеза бактериями, сконструированными методами генетической инженерии. Инсулин стал первым коммерческим генноинженерным продуктом, продуцируемым бактериями, разрешенным к широкому применению в терапии диабета.

Ген инсулина млекопитающих содержит интрон, поэтому для клонирова­ния нельзя было использовать сам ген, так как бактерии не способны к сплайсингу. Оставалось две возможности: использовать кДНК, полученную копированием проинсулиновой мРНК, либо синтезировать кодирующие по­следовательности химическим путем. На самом деле осуществлены оба экс­перимента, при этом клонирование в бактериях проинсулиновой кДНК при­водило к образованию предшественника гормона, который не мог превра­титься в клетках E. coli в зрелый инсулин, поскольку в них не осуществляется необходимый специфический посттрансляционный процессинг. Для получе­ния инсулина нужна была дополнительная стадия ферментативного расщеп­ления проинсулина in vitro. В другом, более результативном эксперименте нуклеотидные последовательности, кодирующие А- и В-цепи инсулина, син­тезировали химически. Для этого вначале определили последовательность аминокислот в А- и В-цепях инсулина и предсказали последовательность нуклеотидов во фрагментах ДНК на основании генетического кода. А-фрагмент содержал 69 пар нуклеотидов: 60 п. н. — кодирующая часть, плюс стартовый (ATG) и терминирующий (TGA) кодоны. Фрагмент В содержал 96 п. н. (рис. 21.3).

Стартовые метиониновые кодоны вводили в состав фрагментов гена ин­сулина для того, чтобы можно было отделить цепи инсулина от прокариоти­ческих аминокислотных последовательностей (N-участок ß-галактозидазы).

Рис. 21.3. Схема процесса образования человеческого инсулина бактериями E.coli. RI — рестриктаза типа I; CnBr — цианогенбромид

Для экспрессии клонированных генов инсулина в клетках кишечной па­лочки осуществляли встраивание каждого синтезированного фрагмента в плазмидный вектор под контроль ß-галактозидазного промотора Данный ре­гуляторный элемент выбран неслучайно. Уже упоминалось, что эукариотиче­ские белки, накапливаясь в клетках прокариот в больших количествах, тор­мозят их рост в основном из-за токсичности, а также деградируются протеа­зами. В таких случаях полезным может оказаться выращивание бактериальных клеток до высокой плотности, после чего их индуцируют к синтезу про­дукта. Известно (глава 3), что лактозный оперон E.coli регулируется по типу индукции, т. е. инкубирование клеток с рекомбинантными ДНК в отсутствие индуктора позволяет им быстро достичь необходимой плотности популяции (инсулиновые гены не транскрибируются), а когда в культуральную жидкость вносят индуктор (изопропилтиогалактозид), клетки начинают массово синте­зировать цепи инсулина.

Итак, компетентные клетки E.coli трансформировали гибридными векторами и отбирали потомство на среде с ампициллином (рис. 21.3). В транс­формированных бактериях синтезировались предшественники А- и В-цепей инсулина. С помощью цианогенбромида, разрушающего метионин и с мень­шей эффективностью триптофан, от предшественников отщепляли короткий ß- галактозидный участок вместе с одним остатком метионина (эти белки не содер­жат других остатков метионина и триптофана).

После очистки А и В-цепи смешивали в условиях, способствующих обра­зованию прочных бисульфидных связей, в результате чего получался чистый человеческий инсулин.

Разработка методов генетической инженерии изменила структуру и со­держание современной промышленной микробиологии. Во-первых, значи­тельно возросла продуктивность микроорганизмов, используемых для синтеза биологически активных веществ (сайт-специфический мутагенез в области регуляторных элементов генов, амплификация генов, введение в геном новых кодирующих последовательностей и т. п.). Во-вторых, появилась возмож­ность менять питательные потребности продуцентов, придавать им устойчи­вость к определенным факторам окружающей среды, повышать их конкурен­тоспособность, скорость роста и др. Наконец, изменилась сама логика про­мышленной микробиологии: ранее для обнаруженного вновь продуцента ка­кого-либо метаболита создавались методы и средства его биотехнологической эксплуатации, теперь появилась возможность воспользоваться только геном или группой генов нового штамма и перенести их в адаптированный для про­изводства соответствующей категории веществ, хорошо изученный микроор­ганизм.