ЕКОЛОГІЧНА БІОХІМІЯ - Навчальний посібник - В. М. Ісаєнко 2005
Розділ. 11 ЕКОЛОГІЧНА БІОХІМІЯ І БІОТЕХНОЛОГІЯ
11.3.Біосенсори
Біотехнологія широко використовується для створення біосенсорів (лат. bios — життя і sensus — почуття) — пристроїв для кількісної реєстрації хімічних і фізичних агентів. Цей пристрій містить: 1) біокаталізатор (фермент, поліферментний комплекс, клітинна органела, тканина, рецептор, антитіло, антиген тощо); 2) детектор (датчик), який реєструє продукти взаємодії біокаталізатора з агентом, що визначається у вигляді сигналу, найчастіше електричного імпульсу.
Біосенсори мають низку переваг перед традиційними фізико- хімічними аналізаторами. Насамперед це висока чутливість (здатність визначати кількість реєструємої речовини 10-12 г і навіть менше) і специфічність. Біосенсори відносно прості за конструкцією, надійні та мініатюрні, вони здатні одночасно визначати кілька речовин або параметрів. Біосенсори розрізняються за типом каталізатора, будовою фізико-хімічного детектора (потенціометричні, п’єзометричні, оптичні та ін.), конструкцією (біосенсори-ферменти, біосенсори-індикатори у вигляді паперових смуг, мембранні біосенсори тощо), часом дії (безперервні або ті, що дають одинокі сигнали).
Потенціометричні біосенсори кількісно реєструють ті чи інші агенти, в основному хімічні сполуки, за різницею електричних потенціалів між детекторним електродом, який контактує з аналізованим зразком, і електродом порівняння. На поверхні детекторного електрода міцно закріплений імобілізо (лат. immobilis — нерухомий) біокаталізатор, який розщеплює ферментативно реєстровану сполуку з утворенням іонізованих або в газовій фазі речовин. Залежно від цього детекторні електроди бувають іонселективними або газовими. У цих електродах є іонселективна мембрана, на якій виникає різниця електричних потенціалів. Розроблені електроди для селективної реєстрації Н+(pH-електроди), Na+, K+, Mg2+, Cr2+, Сu2+, Ag2+, S2-, I-, Вr-, Сl-, F-, NH+, CN- , SCN-, NO3-, NCO3-, CIO4- та інших іонів. Матеріалами для виготовлення електродів слугують скло, кристалічний LaF2, полівінілхлорид (електроди з твердою мембраною), комплексотворні речовини, розчинені в рідинах, що не змішуються з водою (електроди з рідкою мембраною) або включені в інертну полімерну плівку (плівкові електроди). Як електрод порівняння використовують Ag/AgCl електрод.
У газових електродах іонселективна мембрана виокремлена від аналізованої речовини повітряним прошарком. Такі електроди взаємодіють тільки з газами: СO2, NH3, H2S тощо.
Розроблені також потенціалметричні біосенсори без використання електродів — на основі польових транзисторів — на глюкозу (з глюкозооксидазою), ацетилхолін (з холінестеразою), сечовину (з уреазою) та ін.
Амперометричні біосенсори вимірюють силу електричного струму, яка виникає між детекторним електродом і електродом порівняння. Поширений амперометричний біосенсор використовує платиновий електрод, який може реєструвати O2 (стосовно Ag/AgCl-електрода порівняння) або Н2O2. Цього типу біосенсори можуть включати редокс-медіатори, які вільно дифундуюють у розчині або ковалентно пришиті до біокаталізатора чи електрода (цитохром с, феродоксин, фероцен, N-метилфеназин з тетрационохінодиметаном та ін.).
Кондуктометричні біосенсори реєструють продукти біокаталітичної реакції, здатні змінювати електричну провідність розчину між електродами.
П’єзометричні біосенсори реєструють утворення на його поверхні комплексу імобілізованого біооб’єкта з речовиною, кількість якої визначається за зміною частоти п’єзоелектрика (зокрема кварцу). До цього типу біосенсорів близькі за принципом дії біосенсора з детекторами поверхневих хвиль.
Калориметричні біосенсори реєструють теплоутворення, яке супроводжує ферментативні або імунологічні реакції. Датчиком у таких біосенсорів, як правило, є термістри.
Оптичні біосенсори реєструють під час перебігу реакції зміни оптичної щільності, флуоресценції доданих люмінофорів, повороту площини поляризації світла, поверхневого резонансу в разі потрапляння променя світла на тонку металеву пластинку, інтенсивності променів, які проходять через межу розподілу фаз вода — повітря тощо.
Найчастіше в біосенсорах як чутливий елемент використовують ферменти. Вони закріплюються на детекторі різними способами: за допомогою мембран, сітки, включення в капсулу, ліпосом ковалентним зв’язуванням з поверхнею носія, поперечним зшиванням з носієм, інертним білком або один з одним, абсорбцією на носії тощо. У кожному конкретному випадку метод імобілізації залежить від характеристик біооб’єкта, властивостей реєстрованої речовини або явища, умов функціонування біосенсора, типу фактора тощо.
У біосенсорах на основі гідролізу найчастіше використовують потенціометричний детектор з іонселективними чи газовими електродами або на основі польових транзисторів.
Оксидазні біосенсори застосовують, як правило, амперометричні детектори з О2 або Н2О2-електродами. Найпоширенішими є біосенсори на основі імобілізованої глюкозооксидази (ГлО) —- ФАД- вмісного ферменту з Aspergillus niger:
Простіший біосенсор з глюкозооксидазою має вигляд поперечної смужки, на яку нанесено речовину, що змінює колір під час утворення Н2О2. Оптичний детектор визначає кількісний вміст глюкози.
Крім сенсорів О2 або Н2О2 — електродами розроблено також інші — з використанням фероцену, органічних солей, за реєстрації оптичної щільності кольорового pH-індикатора та ін.
Визначення концентрації НАД(Ф)Н можна проводити біосенсорами, які визначають оптичну щільність або флуоресценцію окисненої форми цих сполук, амперометрично електродом з органічних солей (наприклад, солі тетраціанохінодиметану й тетратіафульвалену), платиновим електродом за наявності медіаторів (наприклад, фероцену) тощо.
За допомогою біосенсорів, які містять АТФ-залежні ферменти, можна визначати кількість АТФ — за люцеферин-люцеферазною реакцією при реєстрації свічення, амперометричним біосенсором з гексокіназою, глюкокіназою та ін.
Існує ще багато інших біосенсорів для реєстрації найрізноманітніших біологічно активних речовин з використанням ферментів.
У комбінації з потенціометричними (або газовими) і амперометричними електродами для реєстрації речовин і біохімічних параметрів використовують мікроорганізмені (клітинні) біосенсори. Так, наприклад, за кількістю поглинання О2 амперометрично або потенціометрично за утворенням СО2 клітинами гриба Trichosporon cutaneum або бактерії Azotobacter vinelandii та ін., а також імобілізованих ціанобактерій (за оцінкою активності фотосистеми) можна визначити забрудненість органічними сполуками води. Можливе також спільне використання кількох видів мікроорганізмів і ферментів для проведення багатостадійних реакцій.
Більш специфічними до речовин, ніж мікроорганізмені, є біосенсори на основі тканин рослин і тварин. Складні органічні сполуки в цьому разі здатні розпадатися до простіших іонів або газів, що дає можливість реєструвати їх іонселективними або газовими електродами.
Використання рецепторних систем різних організмів дає можливість створення рецепторних біосенсорів. Так, наприклад, пучок або окремі нерви вусів краба чутливі до амінокислот і гормонів, рецептори носа собаки — до наркотиків тощо. Чутливим може бути не тільки весь рецепторний орган, а й окремі клітини та навіть їхні органели.
В основі функціонування імунобіосенсорів лежить специфічна взаємодія антигена з антитілом. Ці біосенсори здатні реєструвати різні антигени й гаптени, а також клітини, органели, віруси тощо, що їх містять, за утворенням імунного комплексу з імобілізованими на детекторі антитілами. Можлива також імобілізація на детекторі антигенів або гаптенів, а визначається антитіло. П’єзоелектричні й на основі реєстрації поверхневих хвиль детектори фіксують зміну маси під час зв’язування антигена з антитілом, колориметричні — теплоутворення за імунних реакцій, польові транзистори — поверхневий заряд на детекторі тощо.
Існують імуносенсори, здатні визначати не комплексоутворення антигена з антитілом, а певної мітки — люмінесцентної, радіоактивної, ферментативної тощо, яка міцно зв’язується з компонентами імунного комплексу.
Існує також багато інших різновидів біосенсорів. Вибираючи той чи інший, варто враховувати їхню чутливість, стабільність, необхідність регенерувати детектор, час дії тощо.
Біосенсори широко використовують у медицині, сільському господарстві (ветеринарії, зоотехніці, агрономії та ін.), харчовій промисловості, природоохоронній діяльності, під час створення біотипів розроблюваних біокомп’ютерів тощо.