Основы биохимической инженерии Часть 1 - Бейли Дж., Оллис Д. 1989

Кинетика катализируемых ферментами реакций
Инактивация ферментов
Методы стабилизации ферментов

Помимо поиска более устойчивых природных форм существует ряд методов повышения стабильности уже известных ферментов. Эти методы можно разделить на три основные группы:

а) добавление стабилизирующих веществ к среде, в которой хранится фермент или проводится ферментативная реакция;

б) химическая модификация растворимого белка;

в) иммобилизация белка на поверхности либо во всем объеме нерастворимого твердого носителя или матрицы. В нашем кратком обзоре основное внимание будет уделено первым двум методам стабилизации, а иммобилизацию и ее влияние на устойчивость белков мы обсудим в следующей главе.

К веществам, повышающим устойчивость белков, относятся субстраты, органические растворители и соли. Поскольку активный центр фермента часто представляет собой одновременно и наиболее лабильный участок его молекулы, то присутствие субстрата может стабилизировать фермент путем закрепления части молекулы белка в виде фермент-субстратного комплекса. С другой стороны, известны случаи дестабилизации ферментов соответствующими субстратами. Растворители типа многоатомных спиртов, стабилизирующие некоторые ферменты, возможно, повышают устойчивость внутримолекулярных водородных связей белка.

При низких концентрациях солей (<0,1 М) ряд катионов, например Са²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Мо²⁺ и Сu²⁺, специфично взаимодействуют с особыми ферментами, называемыми металлоферментами. Некоторые из перечисленных катионов являются кофакторами, и их присутствие стабилизирует фермент. Катион Са²⁺ участвует в стабилизации третичной структуры ряда белков. Образуя ионные связи с двумя различными аминокислотными остатками, ионы Са²⁺ могут выполнять функцию стабилизирующего мостика аналогично дисульфидным связям.

Таблица 3.11. Примеры методов стабилизации ферментов

Примеры влияния различных веществ на стабильность ферментов приведены в табл. 3.11, а более подробные сведения читатель сможет найти в обзоре [4]. Следует подчеркнуть, что влияние данного вещества или фактора на стабильность какого-либо фермента не всегда означает, что это вещество или фактор будут таким же образом действовать и на другие ферменты. С другой стороны, стабилизирующий эффект часто проявляется только при определенном сочетании состава раствора и температуры; например, добавление небольших количеств ряда солей стабилизирует ферменты, а более высокие концентрации тех же солей обычно вызывают их денатурацию. Это правило относится и к органическим растворителям.

Для повышения стабильности ферментов сравнительно успешно использовался также такой важный инструмент биохимических исследований, как химическая модификация белков. В одном из вариантов этого метода модификации подвергают боковые цепи остатков некоторых аминокислот, например путем ацилирования, восстановительного алкилирования или конденсации аминогрупп нативного белка с боковыми цепями полиаминокислот.

Другой вариант химических методов стабилизации белков основан на применении бифункциональных реагентов, например глутарового альдегида. Такие реагенты образуют поперечные связи между аминогруппами белка и тем самым, во-первых, затрудняют доступ протеаз к белку и, во-вторых, могут закреплять активную конформацию белка. Для химической стабилизации могут применяться и диимиды, связывающие поперечными амидными связями аминные и карбоксильные группы. Эти реагенты и соответствующие реакции мы рассмотрим подробнее в ходе изучения их применения для иммобилизации ферментов.