Основы биохимической инженерии Часть 1 - Бейли Дж., Оллис Д. 1989
Введение в микробиологию
Строение клеток
Фракционирование клеток
Основная проблема в изучении свойств определенных органоидов из данного типа клеток заключается в получении достаточного для последующего биохимического анализа количества этих органоидов. Обычно для этой цели выделяют большое число органоидов из большого числа клеток (из так называемой популяции клеток). Как правило, стандартная методика выделения органоидов включает в себя в качестве первой стадии гомогенизацию суспензии клеток в специальном растворе с помощью трубки с вращающимся пестиком или ультразвука. Таким путем пытаются разрушить клетки, не затрагивая содержащиеся в них органоиды и не нарушая их структуру. Следующая стадия заключается во фракционировании полученной суспензии, которая в идеальном варианте представляет собой смесь выделенных из клеток целых органоидов.
Как инженеры-технологи, мы знаем, что любой процесс разделения основан на различиях в физических и (или) химических свойствах разделяемых компонентов. Обычный метод фракционирования органоидов клетки базируется на различиях в их физических характеристиках: размере частиц, их форме и плотности. Упрощенно процесс центрифугирования рассмотрен в приведенном ниже примере.
РИС. 1П1.1. При вращении центрифуги с высокой скоростью суспендированные в центрифужных пробирках частицы движутся в направлении от оси вращения. Поскольку скорость движения этих частиц зависит от их размеров, формы и плотности, метод центрифугирования позволяет разделять частицы, различающиеся по этим параметрам.
Пример 1.1. Изучение движения частицы в условиях центрифугирования.
Предположим, что сферическая частица радиусом R и плотностью рр помещена в центрифужную пробирку, содержащую жидкую среду плотностью рj и вязкостью μс. Если затем эту пробирку укрепить в центрифуге и вращать с угловой скоростью ω (рис. 1П1.1), то можно вычислить параметры движения частицы, используя следующее уравнение (какие допущения приняты в этом уравнении?) :
Сила сопротивления среды = выталкивающей силе
(1П1.1)
где ur — скорость частицы в направлении r:
(1П1.2)
и G — центробежное ускорение:
(1П1.3)
Для определения действующей на частицу силы сопротивления среды в уравнении (1П1.1) использован закон Стокса, так как в условиях центрифугирования скорости частиц (и, следовательно, их числа Рейнольдса) обычно очень малы. Коэффициент силы тяжести в уравнении (1П1.1) отсутствует, поскольку направление г перпендикулярно направлению силы тяжести (см. рис. 1П1.1). В то же время при вращении ротора центрифуги с большой угловой скоростью развивается ускорение G, которое обычно во много раз превосходит силу тяжести и может достигать величин 600—600 000 g.
РИС. 1П1.2. Основные стадии процесса разделения структурных элементов клеток методом центрифугирования. На более поздних стадиях процесса выделяют все более и более мелкие компоненты клеток.
Интегрированием указанного выражения можно определить время, необходимое ДЛЯ движения частицы из положения r1 в положение r2:
Сферические частицы различного размера и(или) плотности будут проходить одно и то же расстояние в центрифужной пробирке за разное время; этот факт лежит в основе дифференциального центрифугирования. Поскольку относительно большие частицы, например ядра и интактные клетки, осаждаются довольно быстро, их можно собрать и отделить в виде осадка после центрифугирования суспензии в течение ограниченного времени при сравнительно невысоких скоростях. Затем супернатантную суспензию подвергают повторному кратковременному центрифугированию при более высоких скоростях вращения ротора, после чего отделяют второй осадок, содержащий митохондрии. Продолжая эту операцию, получают ряд фракций компонентов клетки. Весь процесс схематично изображен на рис. 1П1.2.
В более сложных методах центрифугирования применяют жидкие среды с градиентом плотности по высоте центрифужной пробирки. Эти методы используются также для предварительного разделения и фракционирования более мелких компонентов клетки, например некоторых типов макромолекул. Другие полезные методы разделения таких сложных смесей, основанные на различиях химических свойств разделяемых компонентов, подробнее будут рассмотрены в гл. 11.
В применении и интерпретации результатов фракционирования компонентов клеток методом центрифугирования имеется ряд ограничений, хорошо освещенных в книге Малера и Кордеса (Mahler Н. R., Cordes Е. Н., Biological Chemistry, 2nd ed., Harper and Row, Publishers, Inc., New York, 1971). Одна из трудностей характерна для любых работ в области изучения и применения микроорганизмов. Для того чтобы получить достаточное для последующих работ количество клеток, органоидов, биологически важных молекул и других компонентов клеток, мы вынуждены использовать популяцию, т. е. большое число индивидуальных клеток. Обычно принимается, что эта популяция гомогенна, или, иными словами, все входящие в ее состав микроорганизмы идентичны. В таких случаях популяция нужна только для увеличения числа этих микроорганизмов с тем, чтобы облегчить дальнейшие экспериментальные исследования.
Обычно, однако, входящие в состав популяции микроорганизмы в той или иной степени различны; такую популяцию называют гетерогенной. Например, в популяции растущих клеток имеются старые и молодые, большие и малые клетки, часто различающиеся по биохимическому составу и активности. Если же рассматривать структурные элементы клетки, то следует отметить, что органоиды одного типа, например митохондрии, находящиеся в одной и той же клетке, также несколько отличаются друг от друга. Поэтому содержащая митохондрии клеточная фракция также представляет собой гетерогенную популяцию. При дальнейшем изучении таких смесей определяют, по сути дела, некоторые усредненные характеристики популяции клеток, и, следовательно, найденные параметры будут зависеть от состава популяции.