Основы биохимической инженерии Часть 1 - Бейли Дж., Оллис Д. 1989
Применение реакций, катализируемых ферментами
Кинетика реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами
Влияние ингибиторов, температуры и pH на каталитическую активность и инактивацию иммобилизованных ферментов
В предыдущей главе были рассмотрены математические выражения, описывающие процессы инактивации ферментов и влияние различных параметров (концентраций ингибиторов и активаторов, температуры, pH, ионной силы и т. д.) на ферментативную активность в растворах. В общем случае можно ожидать, что эти выражения будут пригодны и для описания зависимости собственной активности иммобилизованного фермента от различных параметров. В то же время, как мы уже не раз отмечали, иммобилизация может сопровождаться изменением собственных свойств фермента. Так, иммобилизованные ферменты могут иметь другие константы скорости реакций; более того, иммобилизация может даже потребовать изменения формы уравнений, описывающих влияние параметров реакции на собственную активность фермента. Для определения отклика собственной каталитической активности иммобилизованного фермента на изменения параметров реакции необходимо тщательное изучение кинетики реакции с применением описанных выше методов, позволяющих изучать только собственное кинетическое поведение системы, а не сочетание скоростей массопередачи и каталитических реакций.
В настоящем разделе мы прежде всего постараемся подчеркнуть то влияние, которое процессы массопередачи могут оказывать на взаимосвязь между кажущейся общей каталитической активностью иммобилизованного фермента и условиями среды. Все необходимые данные могут быть получены путем изучения кинетики реакций первого порядка. Прежде всего следует запомнить, что наблюдаемая общая кинетика реакций с участием иммобилизованного фермента, функционирующего в лимитируемом реакцией режиме, не отличается от собственной локальной кинетики этой ферментативной реакции. Следовательно, изучаемая в этом режиме реакция будет иметь первый порядок, а константа скорости процесса будет равна собственной константе скорости ферментативной реакции. В случае же иммобилизованного ферментного катализатора, функционирующего в лимитируемом диффузией режиме, кажущийся порядок реакции также будет первым, но кажущаяся константа скорости будет равна квадратному корню из собственной константы скорости ферментативной реакции. [В общем случае если реакция протекает по n-му порядку, то кажущийся порядок этой реакции в лимитируемых диффузией условиях будет равен (n+1)/2.] Таким образом, кажущаяся энергия активации составит лишь половину истинной энергии активации. Точно так же и влияние изменения любых параметров реакции на наблюдаемую общую кинетику процесса будет меньшим, чем действительный эффект изменения этих же параметров на локальную, собственную кинетику ферментативной реакции. Например, если процессы инактивации, введение ингибитора или изменение pH уменьшают константу скорости собственно ферментативной реакции в 4 раза, то в лимитируемых диффузией условиях наблюдаемая общая скорость процесса уменьшится только в 2 раза.
Из всего сказанного следует, что при изучении влияния параметров реакции на кинетику катализируемых иммобилизованными ферментами реакций следует быть предельно внимательным. Если не соблюдены лимитируемые реакцией условия или если экспериментальные данные, полученные в условиях, когда диффузия вносит определенный вклад в течение процесса, не переработаны с целью получения сведений о собственной кинетике ферментативной реакции, то любые выводы о зависимости активности иммобилизованного фермента от условий процесса будут иметь ценность только для данной партии катализатора, только в данных условиях реакции и никоим образом не будут описывать собственное поведение иммобилизованного фермента. В таком случае любые изменения скорости потока раствора субстрата через слой катализатора, размера его частиц, структуры пор, содержания или распределения фермента в частице катализатора будут сопровождаться изменениями найденных ранее зависимостей активности катализатора от параметров процесса. Этот факт еще раз подчеркивает важность и необходимость четкого разграничения собственных свойств иммобилизованного фермента от тех его характеристик, которые обусловлены эффектами массопередачи.
К сожалению, это обстоятельство не учитывалось во многих опубликованных в литературе работах, посвященных изучению зависимостей характеристик иммобилизованных ферментных систем от условий реакции. Поскольку в большинстве случаев иммобилизованные ферменты функционируют в условиях, когда диффузионные эффекты в заметной степени влияют на скорость процесса или даже определяют ее, то многие имеющиеся в литературе экспериментальные данные по определению скоростей инактивации и влияния pH и температуры на кинетику реакций, очевидно, не описывают собственные свойства иммобилизованных ферментов.
В то же время имеется множество фактов, свидетельствующих об изменении собственной кинетики инактивации ферментов после их иммобилизации. Предлагались и постулировались различные механизмы и интерпретации этого явления; некоторые из гипотез, которые мы вкратце здесь рассмотрим, выдержали экспериментальную проверку. Во-первых, вследствие иммобилизации ферменты удерживаются в относительно фиксированном в пространстве положении, что уменьшает вероятность таких взаимодействий между молекулами фермента, которые способствуют их инактивации за счет агрегации или автолиза (в случае протеолитических ферментов). Во-вторых, наличие нескольких связей молекулы фермента с носителем затрудняет нарушение третичной структуры белка. Сообщалось, что попытки создать комплементарную поверхности фермента микроструктуру носителя путем включения фермента в гель сопровождались резким повышением его стабильности. Аналогично иммобилизация стабилизирует активную форму ферментов, состоящих из нескольких субъединиц, и тем самым может замедлять инактивацию, обусловленную диссоциацией олигомерных белков.
Повышенная устойчивость иммобилизованных ферментов может быть также обусловлена благоприятным местным окружением, в меньшей степени инактивирующим белок, чем окружение в растворе. В качестве примеров можно привести носители, поверхности которых обладают буферными свойствами, или снижают местную концентрацию кислорода, или адсорбируют ферментные яды, или катализируют превращение денатурирующих веществ (например, Н2О2) в безвредные соединения. Вероятно, на стабилизацию иммобилизованных ферментов могут оказывать влияние и другие факторы, которые будут выяснены в ходе последующих работ по изучению фундаментальных свойств иммобилизованных ферментов и взаимосвязи между их структурой и функцией.