Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Гидролитическое расщепление белков
Методы гидролиза

Гидролиз белка обычно производят кислотами, щелочами или соответствующими ферментами. В большинстве случаев для гидролиза применяют кипящую соляную кислоту (продажную 35-процентную соляную кислоту разводят перед употреблением до 20,5-процентной). Сухой белок смешивают примерно с 10-кратным объемом 20,5-процентной кислоты и помещают на 30—60 мин. в кипящую водяную баню для предотвращения бурного пенообразования. После этого смесь кипятят с обратным холодильником в течение 12—48 час. По окончании гидролиза большую часть соляной кислоты можно удалить из гидролизата обычной отгонкой или лучше отгонкой в вакууме. Из сухого остатка, содержащего хлоргидраты аминокислот, выделяют свободные аминокислоты путем обработки влажной окисью серебра. При этой процедуре могут, однако, происходить нежелательные побочные явления, а именно: образование некоторыми аминокислотами комплексных солей с серебром. Поэтому, если из гидролизата предполагают выделять свободные аминокислоты, выгоднее заменить соляную кислоту серной. Для гидролиза белков берется 8 н. H₂SO₄ (20 мл в 100 мл раствора). Серная кислота удаляется из гидролизата путем добавления эквивалентного количества гидроокиси бария. Тяжелый осадок сульфата бария нужно несколько раз экстрагировать кипящей водой для извлечения значительных количеств адсорбированных на осадке аминокислот.

При гидролизе белков кислотами рацемизации аминокислот не происходит, т. е. аминокислоты получаются в виде l-аминокислот. В этом состоит преимущество кислотного гидролиза перед щелочным. Большинство аминокислот устойчиво к действию кипящих минеральных кислот. Исключение составляют триптофан, который при таком гидролизе полностью разрушается, и оксиаминокислоты — серин и треонин, разрушающиеся частично. Продукты разложения триптофана превращаются в темнокоричневые вещества, называемые гуминами; гумины образуются, вероятно, в результате конденсации индольного ядра триптофана с небольшими количествами образующихся во время гидролиза альдегидов [1]. Образование гуминов можно предотвратить прибавлением к серной кислоте, применяемой для гидролиза, олова. Это добавление, в силу восстановительного действия олова, препятствует переходу цистеина в цистин [2], но не предохраняет триптофан от разрушения. Той же самой цели можно достичь, если вести гидролиз в смеси 20-процентной соляной и 50-процентной муравьиной кислот [3].

Разрушения триптофана можно избежать, если проводить гидролиз белков не кислотами, а кипящей разбавленной едкой щелочью или баритом. Ввиду того что эти основания обладают очень сильным гидролитическим действием, полный гидролиз белка 4 н. раствором гидроокиси бария достигается за 10 час. [4]. Щелочные гидролизаты бесцветны и не содержат гуминов. К недочетам щелочного гидролиза относится то, что обработка щелочью вызывает рацемизацию аминокислот. Кроме того, при кипячении со щелочами происходит дезаминирование некоторых аминокислот, расщепление аргинина на орнитин и мочевину и разрушение цистина и цистеина.

Гидролиз белка можно проводить и при помощи протеолитических ферментов. Хотя ферментативный гидролиз белка протекает при очень мягких условиях, он редко применяется для препаративных целей, так как для полного гидролиза требуется очень много времени. Недочетом этого метода является и то, что гидролизаты загрязняются продуктами расщепления фермента, который также представляет собой белок.

Для получения более точного представления о структуре белков часто применяют неполный гидролиз белка. Неполный гидролиз можно осуществить несколькими путями: 1) уменьшением продолжительности гидролиза; 2) понижением концентрации гидролизующего агента; 3) проведением гидролиза при пониженной температуре [5].

Так, например, при гидролизе глобина 25 н. серной кислотой при 40° был выделен пептид гистидина [6]. Подобным же образом дипептиды были выделены из гидролизатов, полученных при обработке белков концентрированной соляной кислотой при 37° [7]. Образование при гидролизе пептидов служит указанием на неодинаковую устойчивость различных пептидных связей к гидролизующему агенту. Если, например, подвергнуть яичный альбумин действию 23-процентной соляной кислоты при температуре от 30 до 60°, то быстро расщепляются только 56 пептидных связей этого белка [8].

Для частичного гидролиза белков можно использовать также ферменты. Этим способом из эдестина и глиадина можно получить соответственно аспарагин [9] и глутамин [10]. При обычном полном гидролизе оба указанных амида гидролизуются с образованием аспарагиновой и глутаминовой кислот и аммиака. Поскольку отдельные протеолитические ферменты гидролизуют только определенные пептидные связи, при действии различных ферментов получаются смеси различных пептидов. Так, например, пептиды, содержащие N-связанный пролин, расщепляются эрепсином, но не расщепляются трипсином [11].