Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Величина и форма белковых молекул
Общие данные

Молекулярный вес низкомолекулярных веществ можно определить, растворив эти вещества в подходящих растворителях и измерив наступившее в результате растворения понижение точки замерзания растворителя, повышение его точки кипения или уменьшение давления пара. Удовлетворительные величины получаются при помощи этих методов в тех случаях, когда концентрация растворенного вещества оказывается не ниже 0,01—0,1 М. Для белков, однако, эти методы неприменимы, так как практически невозможно приготовить 0,01 М раствор белка с молекулярным весом, равным 100 000. Такой раствор должен был бы содержать 1 000 г белка в 1 л.

Правда, некоторые белки, например ряд альбуминов, хорошо растворимы, и не представляет труда приготовить их растворы, содержащие 300 г белка на 1 л воды или более. Однако и в этих случаях трудно использовать указанные растворы для определения молекулярного веса белков, так как они обычно содержат следы загрязнений низкомолекулярными веществами, которые могут оказать громадное влияние на результаты определений. Так, например, 1 мМ углекислоты и 1 мМ сывороточного альбумина в равной степени снижают точку замерзания воды, между тем вес 1 мМ углекислоты составляет всего только 0,044 г, а вес 1 мМ сывороточного альбумина — 68 г.

Такие же ошибки, зависящие от наличия загрязнений, возможны и в опытах, в которых молекулярный вес белков определяется по повышению точки кипения или по понижению давления пара растворителя. Из сказанного ясно, что для определения молекулярного веса высокомолекулярных соединений, подобных белкам, необходимо использовать другие методы.

Первые такие определения молекулярного веса белков были основаны на химическом определении тех элементов или аминокислот, которые содержатся в белке в незначительных количествах. Классическим примером такого способа может служить определение молекулярного веса гемоглобина по содержанию в нем железа. В 100 г гемоглобина млекопитающих содержится 0,34 г железа. Атомный вес железа равен 56, и, следовательно, 0,34 г составляют 0,34/56 = 1/165 экв; отсюда количество гемоглобина, связанного с 1 гэкв железа, равно 165∙100 = 16 500. Эта величина, представляющая минимальный молекулярный вес гемоглобина, долгое время рассматривалась как его истинный молекулярный вес. В дальнейшем было установлено, что истинный молекулярный вес гемоглобина в растворе составляет 68 000, из чего можно заключить, что каждая молекула гемоглобина в действительности состоит из четырех более мелких единиц, молекулярный вес которых и был определен по содержанию в них железа.

Таким же путем, по содержанию некоторых аминокислот, были рассчитаны минимальные молекулярные веса ß-лактоглобулина, сывороточного альбумина [1], эдестина [2] и других белков. Хотя подобный химический анализ не дает возможности определить истинные молекулярные веса, а лишь позволяет судить о минимальной их величине, он все же может оказаться очень полезным, в особенности если различные определения (по различным составным частям молекулы) дают одно и то же значение минимального веса.

Физико-химические методы, используемые для определения молекулярного веса белков, основаны на различных принципах и иногда дают сильно отличающиеся друг от друга результаты, толкование которых часто затруднительно и даже не всегда возможно. Это связано с тем, что результаты измерений зависят не только от величины и массы белковых молекул, но также и от их электрического заряда и формы. Последний фактор, в частности, имеет существенное значение в тех случаях, когда определяют скорость движения молекул, например скорость диффузии или скорость оседания в гравитационном поле. В то время как шарообразные молекулы в подобного рода опытах ведут себя закономерно, удлиненные нитевидные молекулы фибриллярных белков обнаруживают аномальное поведение. Отклонение от шарообразной формы приводит к увеличению коэффициента трения и соответственно — к снижению скорости диффузии. При определениях в концентрированных растворах, содержащих нитевидные молекулы, возникают и другие осложнения, зависящие от взаимных столкновений и временных связей молекул друг с другом. На результаты, полученные динамическими методами, влияет также гидратация частиц, поскольку движение молекул через растворитель будет замедлено, если поперечник их увеличится за счет гидратации.

Указанные выше осложняющие факторы не представляют, однако, большой опасности, если исследуется белковый раствор, находящийся в состоянии равновесия, как это бывает, например, при измерении осмотического давления или при определении концентрационного градиента в гравитационном поле ультрацентрифуги. В следующих разделах мы сначала обсудим эти равновесные методы, затем рассмотрим динамические методы и, наконец, некоторые другие приемы определения молекулярного веса белков.