Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953
Величина и форма белковых молекул
Скорость оседания белков
Если белковые растворы вращать на ультрацентрифуге с очень высокой скоростью, так, чтобы развить центробежную силу, приблизительно в 500 000 раз превосходящую силу земного притяжения, то белковые частицы будут оседать гораздо быстрее, чем при применении метода седиментационного равновесия. Если молекулярный вес белковых молекул высок, скоростью диффузии можно пренебречь, так как с увеличением молекулярного веса растворенного вещества скорость оседания возрастает, а скорость диффузии значительно уменьшается. Молекулярный вес рассчитывается по формуле:
где R, Т, р и σ — те же величины, что и в предыдущих формулах, D — коэффициент диффузии и s — постоянная седиментации. Постоянной седиментации называется скорость оседания в центробежном поле, сила которого равна единице.
s = (dx/dt)(1/w2x),
где x — расстояние движущейся границы от центра вращения в момент времени t; w — угловая скорость вращения. Белки имеют постоянную седиментации порядка 10-12—10-13 сек. Если мы рассчитываем М по приведенному выше уравнению, ясно, что D должен быть известен. Коэффициент диффузии обычно определяется диффузионным методом, описанным в предыдущем разделе. Хотя скорость оседания и зависит от электрического заряда белковых молекул, влияние этого фактора может быть до некоторой степени исключено прибавлением солей [26].
Сведберг и его сотрудники применили методы седиментационного равновесия и скорости оседания для исследования молекулярного веса большого числа различных белков. Было найдено, что молекулярные веса белков в водных растворах варьируют от 12 000 до нескольких миллионов. Некоторые из полученных молекулярных весов приведены в табл. 2.
Таблица 2 Молекулярные веса, определенные по скорости оседания
|
Белок |
Молекулярный вес |
Ссылка на литературу |
|
Рибонуклеаза |
12 700 |
[27] |
|
Миоглобин |
17 000 |
[20] |
|
Цитохром с |
17 000 |
[20] |
|
Белок Бенс-Джонса |
35 000 |
[20] |
|
ß-Лактоглобулин |
35 400 |
[27] |
|
Яичный альбумин |
45 000 |
[14] |
|
Сывороточный альбумин |
68 000 |
[20] |
|
Гемоглобин человека |
63 000 |
[20] |
|
Тироглобулин свиньи |
630 000 |
[20] |
|
Апоферритин |
465 000 |
[29] |
|
Уреаза бобов |
473 000 |
[30] |
|
Гемоцианин (Helix pomatіа) |
6700000 |
[20] |
|
Вирус табачной мозаики |
~ 40 000 000 |
[38] |
Эдестин из семян конопли, эксцельсин из бразильских орехов, фикоцианин и фикоэритрин из водорослей имеют молекулярные веса порядка 280 000—310 000 [20].
В растворе, содержащем смесь нескольких белков, возникает не одна, а несколько границ. Таким образом, этот метод позволяет обнаружить, однороден или нет тот или иной белок. Так было найдено, что желатина гетерогенна и состоит из частиц с молекулярным весом в пределах 10 000—70 000 [31].
Казеин, зеин и сывороточный глобулин также оказались смесями.
Истолкование результатов, полученных при исследовании растворов гомогенных белков, обычно не встречает затруднений; при изучении же белковых смесей возникают трудности, связанные с образованием комплексных соединений белков друг с другом [32].
Первоначально Сведберг предполагал, что все молекулярные веса белков кратны 17 000. Однако позднее было найдено, что некоторые величины требуют исправлений (см. табл. 2), поэтому в настоящее время трудно сказать, представляют ли приведенные в таблице цифры (68 000; 35 000 и 17 000) интерес именно с этой точки зрения. Более высокие молекулярные веса, порядка 200 000, не могут пролить свет на эту важную проблему, поскольку экспериментальная ошибка возрастает с увеличением молекулярного веса. Эта ошибка может достигнуть 17 000, если молекулярный вес превосходит 200 000 [33].