Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953
Взаимодействие белков с водой
Растворимость белков в воде
Растворимость белков в воде варьирует в широких пределах. Одни белки легко растворяются в воде, не содержащей солей, другие, наоборот, растворяются только в воде, содержащей определенное количество солей; белки третьей группы нерастворимы в воде, но растворяются в смеси воды и спирта; белки четвертой группы — склеропротеины — не растворяются ни в каких растворителях. Эти особенности белков послужили основой для разделения их на альбумины, глобулиноподобные белки, проламины и склеропротеины. Такая классификация является более или менее искусственной, и значение ее ограниченно. Так, например, одни гемоглобины легко растворимы в воде, не содержащей солей, другие же почти нерастворимы в отсутствие солей, но легко растворяются при их добавлении.
Можно ожидать, что те белки, которые имеют большое сродство к воде и сильно гидратируются, будут значительно легче растворяться в воде. Однако растворимость и способность к гидратации не зависят друг от друга. Так коллаген имеет значительно большее сродство к воде, чем сывороточный альбумин, и в сухом виде при выдерживании в атмосфере водяного пара связывает больше воды, чем альбумин (см. фиг. 23). Тем не менее коллаген нерастворим в воде, тогда как сывороточный альбумин растворяется в воде легко.
Растворимость белков в воде, несомненно, определяется их химической структурой, т. е. природой и числом аминокислот и их расположением в молекуле белка. Естественно предположить, что большое количество положительно или отрицательно заряженных ионных групп будет увеличивать как сродство белков к воде, так и их растворимость. Такая зависимость, действительно, наблюдается, однако ионные группы могут оказывать и обратное действие, легко соединяясь с ионными группами противоположного знака и образуя солеобразные связи как внутри белковой молекулы [34], так и с примыкающими белковыми молекулами. Образование солеобразных связей всегда ведет к дегидратации [34], а возникновение этих связей между молекулами способствует образованию крупных нерастворимых белковых агрегатов. По этой причине многие белки нерастворимы, несмотря на наличие в них большого количества анионных и катионных групп. Мы в настоящее время не можем, исходя из аминокислотного состава белка, предсказать, какова будет его растворимость в воде. Мы не можем также объяснить, почему растительные проламины растворимы в спирте. Это свойство обычно объяснялось высоким содержанием в них пролина, который растворим в спирте. Коллаген, однако, несмотря на еще более высокое содержание в нем пролина, в спирте нерастворим.
При исследовании растворимости синтетических полипептидов было обнаружено, что полипептиды, содержащие аминокислоты только одного типа, легко образуют коллоидные растворы; так, например, аланилгексапептид, содержащий шесть молекул аланина, является белковоподобным коллоидным веществом, гигроскопичным и набухающим при связывании воды [35].
Хорошо известно, что растворимость белков находится в тесной зависимости от pH и от концентрации солей в растворе. Минимум растворимости наблюдается при изоэлектрической точке. Если же к белку в изоэлектрической точке добавить кислоту или щелочь, то растворимость его увеличится. Плохая растворимость белков в изоэлектрической точке используется для выделения их из смеси с другими белками. Осаждение белков в изоэлектрической точке происходит, вероятно, за счет появления солеобразных связей между анионными и катионными группами соседних молекул белка (см. гл. VII).
Нейтральные соли оказывают двоякое действие на растворы белков. Низкие концентрации их увеличивают растворимость белков, высокие — уменьшают ее и способствуют образованию осадков. Первое действие известно под названием растворяющего эффекта, осаждение же, вызываемое высокими концентрациями солей, — под названием осаждающего эффекта.
Растворяющее действие солей особенно четко проявляется в тех случаях, когда белок нерастворим в дестиллированной воде. Так эвглобулины сыворотки крови или растительные глобулины нерастворимы в воде, но легко растворяются после добавления хлористого натрия к суспензии белка в воде. Способность нейтральных солей стимулировать растворение белков объясняется электростатическим взаимодействием между их ионами и заряженными группами белка [37]. Как упоминалось в гл. V, растворы белка в изоэлектрической точке содержат не только изоэлектрические молекулы Р с нулевым свободным зарядом, но также анионы и катионы белков с формулами Р-, Р--, Р--- ... и Р+, Р++, Р+++... Растворимость этих ионов выше, чем растворимость белка в изоэлектрической точке [36]. Так, например, вычисленная растворимость незаряженных молекул карбоксигемоглобина лошади равна 11 г на 1 л воды при ионной силе, равной нулю, в то время как истинная растворимость смеси незаряженных и заряженных молекул составляет 17 г на 1 л [36]. Количество ионизированных молекул белка увеличивается не только при добавлении кислот или оснований, но также и при добавлении нейтральных солей [36]. Это увеличение может быть причиной повышения растворимости белков, т. е. причиной растворяющего действия солей. Нет необходимости считать, что при этом образуются постоянные прочные связи между ионами белка и ионами добавленных солей [37]. Вероятно, каждая из ионных групп белка окружается, в силу ее электростатического действия, атмосферой солевых ионов противоположного знака. Трудно решить, ведет ли это к образованию постоянных связей между белком и неорганическими ионами (см. гл. V).
Растворимость белков возрастает также при добавлении глицина или других дипольных молекул, увеличивающих диэлектрическую постоянную воды; органические же растворители, понижающие диэлектрическую постоянную воды (например, такие, как спирт), уменьшают растворимость белков в воде [38]. Это действие глицина и органических растворителей используется при фракционировании белков плазмы (см. гл. VIII). При повышении диэлектрической постоянной усиливается ионизация белков, чем и объясняется повышение их растворимости.
Выше уже указывалось, что высокие концентрации нейтральных солей обусловливают выпадение в осадок уже растворенных белков.
Это явление было использовано для получения белковых кристаллов (см. гл. II). Осаждающее действие высоких концентраций солей, очевидно, обусловлено конкуренцией между солью и белком за молекулы растворителя. Ионы солей связывают такое большое количество воды, что остающейся воды недостаточно для растворения белков.
Влияние различных концентраций солей на растворимость белков показано ниже, где μ — ионная сила фосфатного буфера при pH 7,4 и температуре 0°, G — количество растворенного мышечного глобулина, выраженное в миллиграммах азота на 1 л солевого раствора [39]:
Как правило, растворимость белков уменьшается при понижении температуры. Если, однако, для высаливания используется сернокислый натрий, то понижение температуры ведет к повышению растворимости. Это объясняется тем, что при понижении температуры часть сернокислого натрия выпадает в осадок, вследствие чего концентрация его в растворе понижается. Поэтому высаливание сернокислым натрием проводится при температуре не ниже 20°.
Из сказанного выше вытекает, что в настоящее время еще невозможно сформулировать какую-либо зависимость между растворимостью белков и их составом или порядком распределения аминокислот в их молекуле. Растворимость вещества в растворителе почти всегда зависит от силы взаимодействия между молекулами растворителя и растворяемого вещества, а также от энергии кристаллической решетки твердой фазы, т. е. от сил, действующих между молекулами растворяемого вещества. Если интенсивность притяжения между молекулами растворяемого вещества и растворителя превышает взаимное притяжение молекул растворяемого вещества, то должно произойти растворение. Так как диаметр молекул глобулярного белка очень велик, то взаимодействовать друг с другом способны только те группы, которые расположены на поверхности молекулы. В связи с этим можно заключить, что растворимость белков будет зависеть главным образом от природы тех групп, которые образуют поверхность крупных частиц, а также частично от распределения ионных и неполярных групп между поверхностью и внутренней частью белковой молекулы [8, 26, 38, 40]. К сожалению, наши знания о таком расположении полярных и неполярных групп очень ограниченны. Некоторые сведения о распределении полярных групп можно получить, определяя прирост диэлектрической постоянной при растворении белков (см. гл. VII).