Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953
Внутренняя структура глобулярных белков
Концевые группы пептидных цепей
Вопрос о том, является ли пептидная цепь прямой или разветвленной, может быть разрешен путем определения числа концевых а-амино- и а-карбоксильных групп (формулы А и Д).
Неразветвленные пептидные цепи обладают лишь одной а-амино- и одной а-карбоксильной концевыми группами, тогда как разветвленные цепи, если они не образуют колец, имеют несколько таких концевых групп. При определении числа концевых а-аминогрупп нужно, однако, всегда помнить, что в боковых цепях, образованных лизином, присутствуют свободные ε-аминогруппы (формула В) и что определение свободных аминогрупп по методу Ван-Слайка дает а-амино- и ε-аминогрупп.
Если количество лизина в белке определить отдельно, то число концевых d-аминогрупп может быть найдено путем вычитания соответствующего числа ε-аминогрупп из общего числа аминогрупп, определенных по методу Ван-Слайка. Подобного рода определения, проведенные с лактоглобулином и инсулином [5], цитохромом с [6] и другими белками, показали, что в этих белках имеется значительный избыток ot-аминогрупп. Данные, полученные таким косвенным методом, не являются, однако, совершенно точными, так как такие аминокислоты, как глицин или цистеин, при обработке азотистой кислотой по методу Ван-Слайка дают больше азота, чем это теоретически следует.
Электрометрическое титрование белков не может быть использовано для определения числа концевых аминогрупп, так как при таком титровании нет заметного перелома кривой в той точке, где кончается титрование аминогрупп и начинается нейтрализация имидазольных групп гистидина [7]. Тщательно проведенное электрометрическое титрование яичного альбумина и лактоглобулина показало избыток лишь в 1—2 свободных аминогрупп, если принять во внимание ε-аминогруппы лизина [8].
Подобные же затруднения возникают при определении числа свободных концевых карбоксильных групп. В этих случаях также необходимо отличать концевые d-карбоксильные группы от ß-карбоксильных групп аспарагиновой кислоты и у-карбоксильных групп глутаминовой кислоты (группы Б и Г в формуле на стр. 122). Значительная часть карбоксильных групп последних двух типов входит в состав амидных группировок CONH2 (см. табл. 1). Остальная часть их, однако, находится в виде свободных карбоксильных групп и электрометрически титруется вместе с концевыми d-карбоксильными группами. Попытки определить число концевых d-карбоксильных групп путем вычитания из общего числа карбоксильных групп, определяемого электрометрически, числа ß- и у-карбоксильных групп, определенных отдельно, наталкиваются на затруднения. Эти затруднения связаны с тем, что число концевых d-карбоксильных групп очень невелико по сравнению с общим числом карбоксильных групп; поэтому даже небольшая ошибка в определении дикарбоновых кислот может повести к большим неточностям при установлении числа концевых d-карбоксильных групп. Из сказанного ясно, что важный вопрос о том, является ли пептидная цепь разветвленной или нет, не может быть разрешен окончательно при помощи указанных прямых методов определения числа концевых групп. В связи с этим был предложен другой путь, а именно: метка концевых групп при помощи каких-либо производных аминокислот и определение последних после гидролиза белка. Наибольшее затруднение, которое встречается на этом пути, связано с нахождением таких соединений аминокислот, которые не расщеплялись бы при гидролизе белков.