Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Белки с ферментативными свойствами
Соединение фермента с субстратом (фермент-субстратный комплекс)

Хотя механизм ферментативного действия нельзя объяснить одним образованием промежуточных соединений между ферментом и субстратом по причинам, которые будут изложены ниже, тем не менее мы должны принять, что первой фазой ферментативной реакции является образование фермент-субстратного комплекса. Одновременно необходимо также допустить, что образовавшиеся фермент-субстратные комплексы неустойчивы и могут существовать только в течение короткого промежутка времени. Если бы фермент образовывал с субстратом очень стабильные комплексы, то все количество фермента оказалось бы в конце концов связанным с субстратом и последний не подвергался бы дальнейшему превращению.

В основе наших взглядов на химические реакции и явление катализа лежит представление о том, что химическая реакция может произойти только в результате столкновений между реагирующими молекулами. Согласно этому допущению, вещества А и В не могут реагировать с образованием С или D, если при этой реакции не образуется, хотя бы временно, комплекс AB.

Хотя этот взгляд и является общепризнанным, ему, однако, противоречат сообщения, указывающие на то, что трипсин может расщеплять сывороточный альбумин даже в том случае, если последний отделен от него пленкой толщиной больше 100 Å [27]. На основании этих опытов было сделано заключение, что ферменты способны воздействовать на субстрат, находящийся от них на определенном расстоянии. Следует, однако, указать, что в настоящее время нет достаточно точных методов, при помощи которых можно было бы полностью исключить неоднородность пленки [28], а следовательно, и возможность проникновения субстрата или фермента через пленку. Поэтому выводы указанных исследований нельзя считать достаточно обоснованными. Вряд ли нужно подчеркивать, что закон действующих масс, так же как и другие основные законы химической кинетики, исходят из признания концепции столкновений между реагирующими молекулами. Представление о реакциях, происходящих между молекулами, которые нe приходят в соприкосновение друг с другом, совершенно несовместимо с многочисленными фактами, подтверждающими молекулярно-кинетическую теорию химических реакций.

Образование в первой фазе реакции фермент-субстратного комплекса впервые нашло свое подтверждение при изучении кинетики реакций в присутствии веществ, обладающих способностью преимущественно связываться ферментом, конкурируя в этом отношении с субстратом. В настоящее время известны две группы таких веществ: продукты реакции и специфические ферментные яды.

Тормозящее влияние продуктов каталитической деятельности ферментов на активность самих ферментов можно продемонстрировать на примере гидролитических ферментов [29—31]. Рассмотрим гидролитический распад вещества AB:

и обозначим фермент-субстратный комплекс через Е(АВ), где Е — свободный фермент. Если гидролиз тормозится при добавлении избытка АОН, но не ВН, то можно с уверенностью сказать, что фермент соединяется с компонентом А субстрата AB, а не с компонентом В. Этим путем было найдено, что гидролиз сахарозы дрожжевой инвертазой угнетается фруктозой и не угнетается глюкозой. Отсюда можно заключить, что фермент соединяется с фруктозным компонентом сахарозы [29, 31]. Первую фазу этой ферментативной реакции можно, следовательно, представить следующим уравнением:

где Е — молекула фермента, А — фруктозный компонент сахарозы, В — глюкозный компонент сахарозы [29, 31].

Соединение фермента с субстратом тормозится также и другими веществами, которые могут образовывать стойкие соединения с ферментом. В качестве общеизвестного примера можно упомянуть тормозящее влияние, которое оказывают цианиды на действие ферментов, содержащих в качестве активной группы гем. Известно, что синильная кислота образует с атомом железа гема стабильный комплекс, лишая тем самым атом железа возможности соединяться с молекулами субстрата.

До сравнительно недавнего времени предположение об образовании промежуточных соединений между ферментом и субстратом основывалось преимущественно на данных, полученных при изучении кинетики реакций для различных условий. Лишь в самое последнее время удалось спектрофотометрическим путем доказать образование пероксидазой и каталазой комплексов с субстратами. Каталаза и пероксидаза являются окрашенными соединениями и имеют характерный спектр поглощения. При образовании этими ферментами промежуточных соединений с субстратами происходят характерные изменения как окраски, так и спектра поглощения. При этом вначале образуется комплекс зеленого цвета, который затем превращается в комплекс красного цвета [32]. Измерение скоростей этих превращений показало, что образование зеленого комплекса происходит очень быстро (k₁≈ 10⁷), превращение же зеленого комплекса в красный происходит медленно (k₂ = 4,0 для пероксидазы). Далее было показано, что промежуточным соединением в реакции между ферментом и субстратом является только комплекс зеленого цвета. Этот зеленый комплекс медленно распадается на свободный фермент и на продукты реакции [33]. По всей вероятности, железо, входящее в состав гема каталазы и пероксидазы, связано с белковым компонентом в реактивном зеленом комплексе посредством ионной связи, а в красном комплексе — посредством ковалентных связей [32, 33]. Если мы обозначим фермент через — трехвалентный ион железа гема, то образование комплекса фермент — перекись водорода можно представить следующим уравнением [32,33]: