Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Белки с ферментативными свойствами
Ферменты, содержащие железо или медь

Железосодержащие ферменты играют очень важную роль в качестве катализаторов окислительно-восстановительных реакций в животном организме; железо входит в состав их простетической группы в комплексном соединении с порфирином.

Одним из представителей этой группы ферментов может служить каталаза. Этот фермент был выделен в кристаллическом виде из печени быка Самнером и Даунсом [112]. Указанные авторы экстрагировали каталазу из печени при помощи водных растворов диоксана и осаждали ее из экстракта, повышая концентрацию диоксана. Перекристаллизация каталазы производилась из водных растворов путем фракционированного осаждения сернокислым аммонием. Каталаза была выделена также из эритроцитов [113]. Молекулярный вес чистого препарата каталазы 225 000—248 000 [101, 113]. Каталаза содержит 0,09% железа, что соответствует содержанию 4 атомов железа в молекуле [101, 113]. Все 4 атома железа связаны с протопорфириновыми остатками [114]. Под действием соляной кислоты часть групп протогема превращается в комплексы железа с биливердином [114]. Протогем может быть отщеплен от фермента при диализе против разбавленной соляной кислоты. Лишенный простетической группы апофермент представляет собой бесцветное соединение, не обладающее каталитической активностью. Эта активность, однако, вновь восстанавливается при соединении с протогемом [115].

Каталаза, как известно, катализирует реакцию окисления-восстановления между двумя молекулами перекиси водорода с образованием) воды и молекулярного кислорода (уравнение 1); сходная же реакция сопряженного окисления-восстановления между перекисью водорода и определенным субстратом, представляющим собой донатор водорода, катализируется пероксидазой (уравнение 2):

Нужно отметить, что между этими двумя очень сходными реакциями нельзя провести резкой грани. В присутствии некоторых субстратов, например спиртов, каталаза действует подобно пероксидазе [116]. Кристаллическая пероксидаза была выделена из хрена Теореллом [117]. Для очистки фермента им было использовано несколько методов: адсорбция на алюминии, осаждение пикриновой кислотой, электрофорез и фракционированное осаждение сернокислым аммонием. Молекулярный вес полученной пероксидазы оказался равным 44 000 [117]. Из молока была выделена другая пероксидаза с молекулярным весом 93 000, получившая название лактопероксидазы [118]. Молекула пероксидазы имеет резко выраженное асимметрическое строение (отношение осей 7:1) [117]. Простетическая группа может быть отщеплена от пероксидазы под действием ацетона и соляной кислоты при —15°. На основании данных, полученных при электрометрическом титровании и при изучении зависимости активности фермента от pH, было сделано заключение, что простетическая группа пероксидазы соединена с апоферментом не только посредством атомов железа, но также при помощи двух карбоксильных групп протогемина. Фермент-субстратные комплексы каталазы и пероксидазы были рассмотрены выше.

Третьим катализатором, содержащим в качестве активной группы протогемин, является цитохром. Это вещество впервые было обнаружено в мышцах Мак-Муном [119], однако в течение долгого времени его считали продуктом распада гемоглобина или миоглобина. Кейлину и Хартри [120] удалось выделить его в чистом виде. Метод, которым воспользовались эти авторы, заключался в осаждении цитохрома из трихлоруксусного экстракта мышц сернокислым аммонием, с последующим диализом для удаления трихлоруксусной кислоты и перекристаллизацией цитохрома при помощи фракционированного осаждения сернокислым аммонием. Выделенный препарат получил название цитохрома с. Два других цитохрома а и b идентифицированы только спектроскопически и пока еще не получены в чистом виде.

Молекулярный вес цитохрома с 13 000; он содержит 0,43% железа [116, 121], т. е. лишь 1 атом железа в молекуле. Белковый компонент цитрохрома необычайно богат лизином, содержание которого составляет 24,7% [121], в связи с чем изоэлектрическая точка цитохрома с находится в щелочной зоне при pH 9,8 Содержание гистидина в цитохроме много ниже, чем в гемоглобине. Простетичеcкой группой цитохрома является протогемин [123], винильные боковые группы которого связаны с группами SH белкового компонента посредством одной или двух тиоэфирных связей [121, 124]:

Возможно, что в фиксации простетичеcкой группы участвуют также имидазольные группы белкового компонента [121]. Атом железа в цитохроме находится в двухвалентной форме и неспособен окисляться молекулярным кислородом [121]. Цитохром не может переносить молекулярный кислород на органические субстраты. Стабильность закисного состояния железа в цитохроме, очевидно, обусловлена тем, что железо связано с белком ковалентными связями, что предохраняет его от окисления молекулярным кислородом. Цитохром дает характерный спектр поглощения, совпадающий со спектром поглощения гемохромогена, т. е. со спектром поглощения ферропорфиринового комплекса. Количество цитохрома в организме значительно меньше количества гемоглобина или миоглобина. Так, например, в теле крысы весом 250 г содержится 3,19 г гемоглобина, 0,101 г миоглобина и только 0,0144 г цитохрома с [125]. Геликорубин, выделенный из улиток, очень похож на цитохром с и, повидимому, заменяет у этих органов цитохром [126, 127].

Ни цитохром, ни каталаза, ни пероксидаза неспособны катализировать окисление органических веществ молекулярным кислородом. Согласно данным Варбурга [128], способностью восстанавливать молекулярный кислород в клетках обладает лишь специфический гемсодержащий белок, которому было присвоено название дыхательного фермент. Молекулярный вес этого белка 75 000 [129]. Этот фермент, согласно Кейлину, катализирует следующую реакцию:

в связи с чем для этого фермента было предложено название цитохромоксидаза [130]. Однако до сих пор еще не установлено, действительно ли дыхательный фермент идентичен с цитохромоксидазой. Дыхательный фермент извлекается из клеток фосфатом при pH 7 и осаждается при доведении pH до 4,5. Цитохромоксидаза содержится в малых гранулах цитоплазмы, переходящих в водный экстракт при извлечении клеток водой и осаждаемых из этих экстрактов путем центрифугирования при высоких скоростях. Истинные растворы этого фермента можно получить при помощи солей дезоксихолевой кислоты [131]. Это говорит о том, что в фиксации фермента в гранулах участвуют липиды.

Цитохромоксидаза до сих пор еще не получена в чистом виде; ее простетичеcкой группой является гемин, который отличается от протогемина, входящего в состав гемоглобина, цитохрома с, пероксидазы и каталазы. Формула этого гемина еще точно не установлена.

Решающее влияние белкового компонента на специфичность каталитического действия хорошо иллюстрируется на примере сравнения каталитических свойств гемоглобина, цитохрома с, каталазы и пероксидазы. Все четыре соединения содержат в качестве простетичеекой группы один и тот же протогем, который связан с белковым компонентом у всех четырех соединений через атом железа. Связывающая группа белкового компонента еще точно не установлена; по мнению некоторых авторов, атом железа связан или с имидазольными или с карбоксильными группами белкового компонента (см. стр. 244). В пероксидазе белок связан также с кислотными боковыми цепями гема, а в цитохроме — с винильными группами гема. Эти различия в строении белкового компонента и в характере связей между белком и гемом обусловливают те большие различия в свойствах, которые наблюдаются у гемоглобина, цитохрома с, каталазы и пероксидазы. Так, например, гемоглобин и гемин имеют слабо выраженную каталазную и более ясную пероксидазную активность (примерно 0,1% активности каталазы или пероксидазы) [98, 132]. Влияние белкового компонента на каталитическую активность указанных соединений видно также из данных, приводимых в табл. 17.

Ферменты, содержащие в качестве активной группы медь [133], подобно цитохромоксидазе, катализируют процесс переноса водорода от окисляемого субстрата к кислороду. Так, например, образование меланинов из тирозина и диоксифенилаланина, вызывающее хорошо известное потемнение на воздухе разреза яблок, картофеля и некоторых других плодов, обусловлено действием ферментов, содержащих медь. Из картофеля при экстрагировании водой с последующим осаждением ацетоном или сернокислым аммонием был выделен фермент, содержащий 0,165% меди [134]. При диализе против синильной кислоты медь отщепляется от этого фермента, однако после удаления цианида она вновь связывается с белком [134]. В кристаллическом виде получены медьсодержащие тирозиназа [135] и аскорбиноксидаза [136]. Молекулярный вес тирозиназы равен 100 000 [137]. Тирозиназа была получена и из животных тканей, например из тканей кузнечика [122], причем этот фермент, подобно тирозиназе из картофеля, также терял медь при диализе против синильной кислоты. Аскорбиноксидаза была выделена также из кабачков [138]. Свойства белковых компонентов медьсодержащих ферментов до сих пор не исследованы, и мы ничего не знаем относительно тех групп в белковой молекуле, которые участвуют в связывании иона меди.

Таблица 17 Влияние белкового компонента на специфичность каталитического действия