ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 2. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ - 2014

ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ

16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

Вопросы и задачи

1. Баланс цикла лимонной кислоты.

В цикле лимонной кислоты принимают участие восемь ферментов: цитратсинтаза, аконитаза, изоцитратдегидрогеназа, α-кетоглутаратдегидрогеназа, сукцинил-СоА-синтетаза, сукцинатдегидрогеназа, фумараза и малатдегидрогеназа.

а) Напишите уравнение реакции, катализируемой каждым ферментом.

б) Назовите кофакторы, необходимые для действия каждого фермента.

в) Для каждого фермента укажите, к какому типу относится катализируемая им реакция: конденсация (образование связи углерод-углерод), дегидратация (отщепление воды), гидратация (присоединение воды), декарбоксилирование (отщепление СО₂), окислительно-восстановительная реакция, фосфорилирование на уровне субстрата или изомеризация.

г) Напишите суммарное уравнение для превращения ацетил-Со А в СО₂.

2. Суммарные уравнения гликолиза и цикла лимонной кислоты.

Напишите полные биохимические уравнения для метаболизма глюкозы при гликолизе, а также для цикла лимонной кислоты с учетом всех кофакторов.

3. Распознавание окислительно-восстановительных реакций в процессах метаболизма.

Биохимическая стратегия многих живых организмов состоит в постепенном окислении органических веществ до СО₂ и Н₂О и в сохранении большей части образующейся при этих процессах энергии в форме АТР. Важно уметь распознавать окислительно-восстановительные стадии метаболизма. Восстановление органической молекулы происходит в результате гидрирования по двойной связи (уравнение 1) или по простой связи с ее расщеплением (уравнение 2). Напротив, окисление является результатом дегидратации. В биохимических окислительно-восстановительных реакциях (ОВР) функцию гидрирования/дегидрирования осуществляют коферменты NAD и FAD в присутствии соответствующих ферментов.

Для каждого из перечисленных ниже превращений укажите, происходит ли окисление или восстановление. Напишите для каждой ОВР уравнение баланса, добавив Н-Н, а где необходимо Н₂О.

4. Взаимосвязь между энергетическим выходом реакции и степенью окисления углерода.

Эукариотическая клетка способна использовать для клеточного дыхания глюкозу С₆Н₁₂О₆ и гексановую (капроновую) кислоту С₆Н₁₄О₂. Пользуясь структурными формулами этих веществ укажите, для какого из них при полном окислении (до СО₂ и Н₂О) выделяется больше энергии в пересчете на 1 г.

5. Никотинамидные коферменты как переносчики водорода в окислительно-восстановительных реакциях.

В присутствии соответствующей дегидрогеназы никотинамидные коферменты (см. рис. 13-24) могут участвовать в обратимых окислительно-восстановительных реакциях со специфическими субстратами. В таких реакциях NАDН + Н⁺ служат источником водорода (см. задачу 2). Если кофермент окисляется, субстрат обязательно восстанавливается:

Для каждой из приведенных ниже реакций определите, окислился субстрат, восстановился или его состояние окисления не изменилось (см. задачу 2). Если состояние окисления субстрата изменилось, напишите уравнение, добавив необходимые количества NАD⁺, NАDН, Н⁺ и Н₂O. Цель этого упражнения заключается в определении, в каких реакциях должен принимать участие окислительно-восстановительный кофермент.

6. Кофакторы и механизм реакции, катализируемой пируватдегидрогеназой.

Опишите роль каждого кофактора, участвующего в реакции, катализируемой пируватдегидрогеназным комплексом.

7. Дефицит тиамина в организме.

У человека, получающего с пищей недостаточное количество тиамина, определяется высокий уровень пирувата в крови. Объясните причину.

8. Реакция, катализируемая изоцитратдегидрогеназой.

Какой тип химической реакции происходит при превращении изоцитрата в α-кетоглутарат? Назовите все кофакторы, задействованные в этой реакции, и объясните их роль. Какие (или какая) еще реакции в цикле лимонной кислоты относятся к тому же типу?

9. Стимуляция потребления кислорода оксалоацетатом и малатом.

В начале 1930-х гг. Альберт Сент-Дьерди сообщил об интересном наблюдении: добавление небольшого количества оксалоацетата или малата к суспензии измельченной грудной мышцы голубя усиливало потребление кислорода препаратом. Удивительно, что количество потребляемого кислорода был в 7 раз выше необходимо для полного окисления добавленного оксалоацетата или малата (до СO₂ и Н₂O). Почему добавление оксалоацетата и малата стимулирует потребление кислорода? Почему количество потребляемого кислорода во много раз превышает необходимое для полного окисления добавленного оксалоацетата или малата?

10. Образование оксалоацетата в митохондриях.

На последней стадии цикла лимонной кислоты происходит дегидрирование малата, в результате чего вновь образуется оксалоацетат, необходимый для включения в цикл новой молекулы ацетил-СоА:

L-Малат + NАD⁺ —> оксалоацетат + NАDН + Н⁺

∆G′° = 30 кДж/моль

а) Определите константу равновесия реакции при 25 °С.

б) Поскольку ∆G′° соответствует стандартному значению при pH 7, константа равновесия (пункт а) определяется формулой:

Как показывают измерения, концентрация L-малата в митохондриях печени крыс составляет -0,2 мМ, а [NАD⁺]/[NАDН] = 10. Определите концентрацию оксалоацетата в митохондриях печени крысы при pH 7.

в) Для оценки концентрации оксалоацетата в митохондриях рассчитайте число молекул оксалоацетата в одной митохондрии. Пусть митохондрия — сферическая частица диаметром 2 мкм.

11. Кофакторы в цикле лимонной кислоты.

Предположим, приготовлен экстракт митохондрий, содержащий все растворимые ферменты матрикса, но при проведении диализа потеряны все низкомолекулярные кофакторы. Что нужно добавить в экстракт, чтобы там осуществлялось превращение ацетил-СоА в СO₂?

12. Дефицит рибофлавина в организме.

Как недостаточность рибофлавина повлияет на функционирование цикла лимонной кислоты? Поясните ответ.

13. Содержание оксалоацетата.

Какие факторы могут снизить количество оксалоацетата, поступающего в цикл лимонной кислоты? Каким образом можно пополнить количество оксалоацетата?

14. Выход энергии в цикле лимонной кислоты.

Реакция, катализируемая сукцинил-СоА-синтетазой, приводит к образованию богатого энергией соединения GTP. Как свободная энергия, запасенная в GTP, «объединяется» с энергетическими запасами клетки, заключенными в АТР?

15. Изучение процесса клеточного дыхания в изолированных митохондриях.

Клеточное дыхание можно изучать на выделенных митохондриях путем измерений количества потребляемого кислорода при различных условиях. Если к активно дышащим митохондриям, использующим в качестве источника энергии пируват, добавить 0,01 М раствор малоната натрия, дыхание быстро прекращается и начинает накапливаться один из интермедиатов метаболизма.

а) Какое строение имеет этот интермедиат?

б) Объясните, почему он накапливается.

в) Объясните, почему прекращается потребление кислорода.

г) Кроме непосредственного удаления малоната, каким еще способом можно снять вызванное им ингибирование? Объясните ответ.

16. Эксперименты с мечеными соединениями на изолированных митохондриях.

Метаболические пути превращения органических соединений часто изучают, используя меченные радиоактивной меткой субстраты и прослеживая судьбу метки.

а) Как проверить, что глюкоза, добавляемая к суспензии изолированных митохондрий, превращается в СO₂ и Н₂O?

б) К митохондриям импульсно добавили [3-¹⁴С] пируват (меченный по метальной группе). Какое положение займет меченый углерод после одного оборота цикла лимонной кислоты? Объясните ответ, проследив путь метки на всем протяжении цикла. Через сколько оборотов цикла весь меченый пируват будет выведен в виде СO₂?

17. Судьба СO₂ в процессе глюконеогенеза.

На первом обходном пути глюконеогенеза — превращении пирувата в фосфоенолпируват (ФЕП) — пируват карбоксилируется с помощью пируваткарбоксилазы, образуя оксалоацетат, который далее декарбоксилируется до ФЕП под действием ФЕП-карбоксикиназы (гл. 14). Поскольку сразу за присоединением С0₂ происходит его отщепление, можно было бы ожидать, что ¹⁴С из ¹⁴СO₂ не включается в ФЕП, глюкозу и другие интермедиаты глюконеогенеза. Однако выяснилось, что при синтезе глюкозы в присутствии ¹⁴СO₂ в печени крысы ¹⁴С постепенно появляется в ФЕП, а затем в положениях С-3 и С-4 в молекуле глюкозы. Каким образом метка ¹⁴С попадает в ФЕП и в глюкозу? (Подсказка. При глюконеогенезе в присутствии ¹⁴СO₂ некоторые из четырехуглеродных интермедиатов цикла лимонной кислоты также получают метку.)

18. Катаболизм [1-¹⁴С] глюкозы. Активно дышащую бактериальную культуру короткое время инкубировали с [3-¹⁴С] глюкозой, а затем выделили из нее интермедиаты цикла лимонной кислоты и гликолиза. Укажите положение метки в перечисленных ниже соединениях. Учитывайте при этом только ту метку, которая включается при первом прохождении меченой глюкозы через метаболические пути.

а) Фруктозо-1,6-бисфосфат.

б) Глицеральдегид-3-фосфат.

в) Фосфоенолпируват.

г) Ацетил-Со А.

д) Цитрат.

е) α-Кетоглутарат.

ж) Оксалоацетат.

19. Роль тиамина в организме.

При заболевании бери-бери, вызванном дефицитом тиамина, в крови пациентов наблюдается повышенное содержание пирувата и α-кетоглутарата, особенно после употребления богатой глюкозой пищи. Как это связано с дефицитом тиамина?

20. Синтез оксалоацетата в цикле лимонной кислоты.

Оксалоацетат образуется на последней стадии цикла лимонной кислоты при NАD⁺- зависимом окислении L-малата. Возможен ли синтез оксалоацетата из ацетил-СоА только под действием ферментов и кофакторов цикла лимонной кислоты без затрат интермедиатов цикла? Объясните ответ. Как пополняются запасы оксалоацетата, выведенного из цикла для осуществления реакций биосинтеза?

21. Истощение (исчерпание) запасов оксалоацетата.

В печени млекопитающих в качестве исходного материала для глюконеогенеза может использоваться оксалоацетат (гл. 14). Повлияет ли интенсивное использование оксалоацетата для глюконеогенеза на протекание цикла лимонной кислоты? Объясните ответ.

22. Механизм действия фторацетата, применяемого как средство против грызунов.

Фторацетат используется для борьбы грызунами и поэтому производится промышленностью; это соединение содержится также в природе в одном из южноафриканских растений. Попадая в клетку, фторацетат превращается в фторацетил-СоА в реакции, катализируемой ацетаттиокиназой:

Токсическое действие фторацетата было изучено на изолированном сердце крыс. После перфузии сердца 0,22 мМ раствором фторацетата уменьшилось поглощение глюкозы, снизилась скорость гликолиза и стали накапливаться глюкозо-6- фосфат и фруктозо-6-фосфат. Определение интермедиатов цикла лимонной кислоты показало, что их концентрации были ниже нормы и лишь концентрация цитрата превышала норму в 10 раз.

а) На какой стадии происходит остановка цикла лимонной кислоты? Почему накапливается цитрат, а запасы других интермедиатов цикла истощаются?

б) В цикле лимонной кислоты фторацетил- СоА подвергается ферментативным превращениям. Какова структура конечного продукта метаболизма фторацетата? Почему он блокирует цикл лимонной кислоты? Каким образом можно снять это ингибирование?

в) Почему после перфузии сердца потребление глюкозы и гликолиз ослабевали? Почему накапливались гексозомонофосфаты?

г) Почему отравление фторацетатом смертельно?

23. Образование L-малата в виноделии.

Терпкий вкус некоторых вин связан с высокой концентрацией в них L-малата. Напишите последовательность реакций, в результате которых дрожжи образуют L-малат из глюкозы в анаэробных условиях в присутствии растворенного СO₂ (НСO₃). Обратите внимание, что в суммарной реакции брожения не должно происходить расходования никотинамидных коферментов или интермедиатов цикла лимонной кислоты.

24. Синтез α-кетоглутарата.

α-Кетоглутарат играет очень важную роль в биосинтезе некоторых аминокислот. Напишите последовательность ферментативных реакций, в результате которых из пирувата образуется α-кетоглутарат. В предложенной цепочке реакций не должно происходить суммарного потребления интермедиатов цикла лимонной кислоты. Напишите уравнение суммарной реакции и укажите источник каждого из реагирующих веществ.

25. Амфиболические пути.

Объясните на примерах, что означает утверждение, что цикл лимонной кислоты является амфиболическим путем.

26. Регуляция активности пируватдегидрогеназного комплекса.

В тканях животных скорость превращения пирувата в ацетил-СоА регулируется соотношением между активным (фосфорилированным) и неактивным (нефосфо-

рилированным) ПДГ-комплексами. Как влияет на скорость данной реакции обработка препарата митохондрий из мышц кролика, содержащего ПДГ-комплекс, (а) киназой пируватдегидрогеназы, АТР и NADH; (б) фосфатазой пируватдеги- дрогеназы и Са²⁺; (в) малонатом.

27. Промышленный синтез лимонной кислоты.

Лимонная кислота используется для придания вкуса безалкогольным напиткам и многим другим продуктам питания. Мировой рынок производства лимонной кислоты оценивается в сотни миллионов долларов в год. Для промышленного производства используют плесневый гриб Aspergillus niger, который выращивают на сахарозе в строго контролируемых условиях.

а) Выход лимонной кислоты сильно зависит от концентрации FeCl₃ в питательной среде (см. график). Почему выход лимонной кислоты снижается при концентрации Fe³⁺ выше или ниже оптимального ее значения в 0,5 мг/л?

б) Предложите последовательность реакций, в соответствии с которой A. niger продуцирует лимонную кислоту из сахарозы. Напишите уравнение суммарной реакции.

в) Нужно ли проводить аэрацию питательной среды при культивировании гриба, т. е. является ли данный процесс аэробным или анаэробным? Объясните ответ.

28. Регуляция активности цитратсинтазы.

В присутствии насыщающей концентрации оксалоацетата зависимость активности цитратсинтазы из ткани сердца свиньи от концентрации ацетил- СоА описывается S-образной (см. график). При добавлении сукцинил-СоА кривая сдвигается вправо, а S-образная форма зависимости становится более выраженной.

На основании этих наблюдений предположите, каким образом сукцинил-СоА регулирует активность цитратсинтазы. (Подсказка. См. рис. 6-29, т. 1.) Почему сукцинил-СоА является подходящим сигналом для регуляции цикла лимонной кислоты? Каким образом регуляция цитратсинтазы контролирует скорость клеточного дыхания в ткани сердца свиньи?

29. Регуляция пируваткарбоксилазы.

Карбоксилирование пирувата под действием фермента пируваткарбоксилазы без аллостерического активатора ацетил-СоА происходит с очень низкой скоростью. Объясните, каким образом эта особенность регуляции связана с тем, что после приема пищи, богатой жирными кислотами (триацилглицеринами) и бедной углеводами (глюкозой), ослабевает процесс окисления глюкозы до СO₂ и Н₂O, но усиливается окисление ацетил-СоА, образующегося из жирных кислот.

30. Связь между клеточным дыханием и циклом лимонной кислоты.

Хотя кислород непосредственно не участвует в цикле лимонной кислоты, цикл осуществляется только в присутствии кислорода. Почему?

31. Влияние отношения [NАDН]/NАD+] на цикл лимонной кислоты.

Каким образом цикл лимонной кислоты отреагирует на быстрое увеличение отношения [NАDН]/[NАD⁺] в митохондриальном матриксе? Объясните ответ.

32. Термодинамика цитратсинтазной реакции в клетках.

Цитрат образуется при конденсации ацетил-СоА с оксалоацетатом, катализируемой цитратсинтазой:

Оксалоацетат + ацетил-СоА + Н₂O —> цитрат + СоА + Н⁺

В митохондриях сердца крысы при pH 7,0 и 25 °С были определены концентрации реагирующих веществ и продуктов реакции (мкМ): оксалоацетат 1, ацетил-СоА 1, цитрат 220, СоА 65. Изменение стандартной свободной энергии для этой реакции составляет -32,2 кДж/моль. Каково направление потока метаболитов в данной реакции в клетках сердца крысы? Объясните ответ.

33. Реакции пируватдегидрогеназного комплекса.

Две стадии окислительного декарбоксилирования пирувата (стадии (4) и (5) на рис. 16-6) не затрагивают ни одного из трех атомов углерода в молекуле пирувата, но они важны для функционирования ПДГ-комплекса. Объясните этот факт.

34. Мутации в цикле лимонной кислоты.

Многие заболевания человека связаны с потерей той или иной ферментативной активности в результате генетической мутации. Однако случаи потери активности какого-либо фермента, участвующего в цикле лимонной кислоты, встречаются чрезвычайно редко. Как это объяснить?

35. Цикл лимонной кислоты и глиоксилатный цикл.

В организмах (например, Е. coli), в которых реализуется как цикл лимонной кислоты, так и глиоксилатный цикл. В каких случаях изоцитрат направляется по одному, а в каких по другому пути?

Анализ экспериментальных данных

36. Как был открыт цикл лимонной кислоты.

Подробный механизм цикла лимонной кислоты был установлен в работах нескольких ученых в течение нескольких десятилетий. Впервые описание этого пути метаболизма было сделано Кребсом и Джонсоном в 1937 г. по итогам собственных исследований, а также по публикациям других ученых.

Методы исследований того времени сильно отличались от современных биохимических методов. До 1940-х гг. радиоактивные метки практически не использовались, поэтому Кребсу и другим ученым приходилось применять другие методы анализа. Потребление кислорода измеряли на свежеприготовленных образцах грудных мышц голубя; для этого измельченную мышечную ткань в буфере помещали в запаянный сосуд и определяли объем кислорода (в микролитрах), потребляемого при различных условиях. С целью количественного анализа интермедиатов образцы обрабатывали кислотой для удаления примесей белка, а затем там определяли содержание низкомолекулярных органических молекул. Два основных наблюдения, позволившие Кребсу и его коллегам сделать вывод, что механизм цикла лимонной кислоты вовсе не линейный (каким является, например, гликолиз), были получены в следующих экспериментах.

Эксперимент I. Инкубировали 460 мг измельченной мышечной ткани в 3 мл буфера при 40 °С в течение 150 мин. Добавление цитрата повышало потребление О₂ на 893 мкл по сравнению с образцами без цитрата. По расчетам, основанным на потреблении О₂ в присутствии других углеродсодержащих веществ, ожидаемое потребление О₂, необходимое для полного исчерпания этого количества цитрата, составляло лишь 302 мкл.

Эксперимент II. Определяли потребление 0₂ в присутствии 460 мг измельченной мышечной ткани в 3 мл буфера при инкубации с цитратом и/или с 1-глицерофосфатом (было известно, что 1-глицерофосфат легко окисляется при клеточном дыхании) при 40 °С в течение 140 мин, Результаты экспериментов представлены в таблице.

а) Почему измерение потребления О₂ позволяет с хорошей точностью оценить клеточное дыхание?

б) Почему образец 1 (мышечная ткань без добавления субстратов) потребляет какое-то количество кислорода?

в) Можно ли на основании результатов для образцов 2 и 3 заключить, что 1-глицерофосфат и цитрат являются субстратами в клеточном дыхании в данной системе? Объясните свои рассуждения.

г) На основании результатов этих экспериментов Кребс с коллегами заключили, что цитрат обладал «каталитическими» свойствами, т. е. он помогал мышечной ткани более полно метаболизировать 1-глицерофосфат. Каким образом этот вывод следует из представленных результатов?

д) Далее Кребс с соавторами утверждали, что цитрат не просто потребляется в данном процессе, но должен регенерироваться. Следовательно, этот процесс является циклическим, а не линейным. Можете ли вы путем обсуждений привденных результатов прийти к такому выводу?

Другие исследователи обнаружили, что арсенат ингибирует активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, а малонат ингибирует активность сукцинатдегидрогеназы.

е) Кребс с сотрудниками выяснили, что мышечная ткань, обработанная арсенатом и цитратом, потребляет цитрат только в присутствии кислорода. На основании данных, отраженных на рис. 16-7, объясните, во что превращался цитрат в этом эксперименте и почему образец потреблял кислород?

Далее в своей статье Кребс и Джонсон сообщали следующее.

1. В присутствии арсената 5,48 ммоль цитрата превращалось в 5,07 ммоль α-кетоглутарата.

2. В присутствии малоната цитрат без остатка превращался в большое количество сукцината и небольшое количество α-кетоглутарата.

3. Добавление оксалоацетата в отсутствие кислорода приводило к образованию большого количества цитрата, причем количество цитрата еще сильнее возрастало при добавлении в среду глюкозы.

Для аналогичного образца мышечной ткани другие исследователи предложили такой путь превращений:

Сукцинат —> фумарат —> малат —> оксалоацетат —> пируват

ж) Только на основании данных, изложенных в настоящей задаче, укажите порядок образования интермедиатов цикла лимонной кислоты. Как этот результат соотносится с данными, представленными на рис. 16-7? Поясните, как вы рассуждали.

з) Почему важно было продемонстрировать количественное превращение цитрата в α-кетоглутарат?

Статья Кребса и Джонсона, кроме того, содержит много других данных, позволяющих

полностью восстановить ход цикла. В то время единственным неизвестным компонентом оставалось вещество, в результате взаимодействия с которым оксалоацетат превращался в цитрат.