ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 2. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ - 2014

ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ

21. БИОСИНТЕЗ ЛИПИДОВ

Вопросы и задачи

1. Путь углерода при синтезе жирных кислот.

Используя знания в области биосинтеза жирных кислот, дайте объяснения двум экспериментальным фактам.

а) Добавление равномерно меченного [¹⁴С]- ацетил-СоА к растворимой фракции печени дает в результате пальмитат, равномерно меченный ¹⁴С.

б) Однако добавление следов равномерно меченного [¹⁴С] ацетил-СоА в присутствии избытка немеченного малонил-СоА к растворимой фракции печени дает пальмитат, меченный ¹⁴С только по С-15 и С-16.

2. Синтез жирных кислот из глюкозы.

После того как у человека завершится переваривание большого количества сахарозы, глюкоза и фруктоза, количества которых превышают энергетические потребности организма, превращаются в жирные кислоты для синтеза триацилглицеринов. При синтезе жирных кислот потребляются ацетил- СоА, АТР и NADPH. Как эти вещества получаются из глюкозы?

3. Общее уравнение синтеза жирных кислот.

Напишите итоговое уравнение биосинтеза пальмитата в печени крысы, начав с митохондриального ацетил-СоА и цитозольных NADPH, АТР и СO₂.

4. Путь водорода в синтезе жирных кислот.

Представьте себе препарат, который содержит все ферменты и кофакторы, необходимые для биосинтеза жирной кислоты из добавленных ацетил- СоА и малонил-СоА.

а) Если [2-²Н] ацетил-СоА (меченный дейтерием ²Н, тяжелым изотопом водорода) и избыток немеченого малонил-СоА добавляются в качестве субстратов, сколько атомов дейтерия включается в каждую молекулу пальмитата? Где они локализованы? Поясните.

б) Если немеченый ацетил-СоА и [2-²Н]- малонил-СоА добавляются в качестве субстратов, сколько атомов дейтерия включается в каждую молекулу пальмитата? Где они локализованы? Поясните.

5. Энергетика β-кетоацил-АСР-синтазы.

В реакции конденсации, катализируемой β-кетоацил- АСР-синтазой (см. рис. 21-6), синтезируется четырехуглеродный модуль путем комбинации двухуглеродного и трехуглеродного модулей с высвобождением СO₂. В чем состоит термодинамическое преимущество этого процесса перед простой комбинацией двухуглеродных модулей?

6. Модуляция ацетил-СоА-карбоксилазы.

Ацетил-СоА-карбоксилаза — главный пункт регуляции в биосинтезе жирных кислот. Некоторые из свойств этого фермента приводятся ниже.

а) Добавление цитрата или изоцитрата повышает Vm_ах фермента в 10 раз.

б) Фермент существует в двух взаимопревращаемых формах, которые существенно различаются по активностям:

Протомер (неактивный) ⇄ филаментный полимер (активный)

Цитрат и изоцитрат связываются преимущественно с протомером.

Объясните, как эти свойства согласуются с регуляторной ролью ацетил-СоА-карбоксилазы в биосинтезе жирных кислот.

7. Челночное перемещение ацетильных групп через внутреннюю митохондриальную мембрану.

Ацетильная группа ацетил-СоА, образующегося при окислительном декарбоксилировании пирувата в митохондрии, переносится в цитозоль «челноком» ацетильной группы, схематически представленном на рис. 21-10.

а) Напишите полное уравнение для переноса одной ацетильной группы из митохондрии в цитозоль.

б) Какова «цена» этого процесса в эквивалентах АТР на ацетильную группу?

в) В гл. 17 мы сталкивались с ацильным челноком в транспорте жирноацил-СоА из цитозоля в митохондрии при подготовке к β-окислению (см. рис. 17-6). Одним из результатов этого челночного переноса было разделение митохондриального и цитозольного пулов СоА. Выполняет ли и это ацетильный челнок? Поясните.

8. Необходимость кислорода для десатураз.

Биосинтез пальмитоолеата (см. рис. 21-12) — широко распространенной ненасыщенной жирной кислоты с цис-двойной связью в положении ∆⁹ — использует в качестве предшественника пальмитат. Может ли этот процесс осуществляться в строго анаэробных условиях? Объясните.

9. Энергетическая «цена» синтеза триацил-глицеринов.

Используйте итоговое уравнение биосинтеза трипальмитоилглицерина (трипальмитина) из глицерина и пальмитата для того, чтобы продемонстрировать, сколько молекул АТР требуется на молекулу образующегося трипальмитата.

10. Кругооборот триацилглицеринов в жировой ткани.

Когда [¹⁴С] глюкозу добавляют в сбалансированное питание взрослых крыс, не наблюдается никакого увеличения общего количества запасаемых триацилглицеринов, но триацилглицерины содержат метку ¹⁴С. Объясните.

11. Энергетическая «цена» синтеза фосфатидилхолина.

Напишите последовательность стадий и итоговую реакцию биосинтеза фосфатидилхолина из олеата, пальмитата, дигидроксиацетонфосфата и холина путем утилизации отходов метаболизма. Исходя из предшествующих данных рассчитайте, какова «цена» (в молекулах АТР) синтеза фосфатидилхолина этим путем.

12. Синтез фосфатидилхолина путем утилизации отходов метаболизма.

Молодые крысы, которые получали пищу без метионина, не могли нормально развиваться, если в их пищевой рацион не был включен холин. Объясните.

13. Синтез изопентенилпирофосфата.

Если [¹⁴С] ацетил-СоА добавлять в гомогенат печени крыс, синтезирующий холестерин, где в ∆3-изопентилпирофосфате (активированной форме изопреновой единицы) появится метка ¹⁴С?

14. Активированные доноры в синтезе липидов.

При биосинтезе сложных липидов сборка компонентов сопровождается переносом нужной группы из активированного донора. Например, активированным донором ацетильных групп является ацетил-СоА. Для каждой из ниже перечисленных групп назовите форму активированного донора: (а) фосфат; (б) D-глюкозил; (в) фосфоэтаноламин; (г) D-галактозил; (д) жирный ацил; (е) метил; (ж) двухуглеродная группа при биосинтезе жирной кислоты; (з) ∆³-изопентил.

15. Важное значение жиров пищи.

При содержании молодых крыс на диете, полностью лишенной жиров, они плохо растут, у них развивается чешуйчатый дерматит, они теряют волосы и скоро умирают. Эти симптомы можно предотвратить, если в диету включать линолеат или растительные продукты. Что делает линолеат незаменимой жирной кислотой? Почему растительный материал может быть заменой?

16. Регуляция биосинтеза холестерина.

Человек может получать холестерин из пищи или синтезировать de novo. Взрослый человек, потребляющий пищу с низким содержанием холестерина, обычно синтезирует в печени 600 мг холестерина в сутки. Если количество холестерина в диете велико, синтез холестерина de novo резко уменьшается. Как осуществляется такая регуляция?

17. Снижение уровня сывороточного холестерина при приеме статинов.

У пациентов, принимающих статины, обычно происходит резкое снижение уровня холестерина в сыворотке крови. Однако при этом может заметно вырасти количество HMG-CoA-редуктазы в клетках. Объясните это наблюдение.

18. Роль тиоэфиров в биосинтезе холестерина.

Предложите механизм для каждой из трех реакций, представленных на рис. 21-34, с указанием пути образования мевалоната из ацетил- СоА.

19. Возможное побочное действие от приема статинов.

Некоторые врачи считают, что пациентам, принимающим статины, следует одновременно назначать прием кофермента Q (хотя клинические испытания, подтверждающие пользу или нежелательное побочное действие такого лечения, еще не были проведены). Объясните смысл подобной рекомендации.

Анализ экспериментальных данных

20. Создание клеток Е. coli, производящих большое количество изопреноидов.

В природе существует большое разнообразие изопреноидов, некоторые из них имеют важное медицинское или коммерческое значение и производятся в промышленном масштабе. Один из способов получения изопреноидов — ферментативный синтез in vitro; однако этот метод дорог и отличается низкой производительностью. В 1999 г. Ванг, Ох и Лиао сообщили о создании штамма бактерии Е. coli, способного производить большие количества астаксантина — изопреноида, активно используемого в коммерческих целях.

Астаксантин — это красно-оранжевый пигмент (антиоксидант), продуцируемый морскими водорослями. Некоторые морские животные (креветки, лобстеры и некоторые виды рыб), использующие в пищу водоросли, приобретают оранжевую окраску в результате накопления в их организме астаксантина. Это соединение с общей формулой С40Н52О4 построено из восьми изопреновых единиц:

а) Изобразите восемь изопреновых единиц в молекуле астаксантина. Подсказка. Используйте выступающие метальные группы.

Путь синтеза астаксантина изображен на следующей странице; он начинается с ∆³-изопренилпирофосфата (IPP). Стадии (1) и (2) изображены на рис. 21 -36, а реакция, катализируемая IPP-изомеразой, представлена на рис. 21-35.

б) На стадии (4) две молекулы геранилгеранилпирофосфата соединяются, образуя фитоен. Происходит ли это присоединение по механизму «голова к голове» или «голова к хвосту»? (Подробности см. на рис. 21-36.)

в) Объясните суть химического превращения, происходящего на стадии (5).

г) Синтез холестерина (рис. 21-37) включает стадию циклизации (замыкания кольца), происходящую при окислении под действием О₂. Происходит ли окисление субстрата (ликопина) при циклизации на стадии (6) в ходе синтеза астаксантина? Поясните свой ответ.

Е. coli не производит изопреноиды в большом количестве и не синтезирует астаксантина. Известно, что эта бактерия синтезирует некоторое количество изопренилфосфата, диметилал- лилпирофосфата, геранилпирофосфата, фарне- зилпирофосфата и геранилгеранилпирофосфата. Ванг и сотр. клонировали некоторые гены Е. coli, кодирующие ферменты, необходимые для синтеза астаксантина, в плазмидах, позволяющих получить высокий уровень экспрессии этих генов. В частности, были клонированы гены idi (ген IPP-изомеразы) и ispA (ген пренилтрансферазы, катализирующей стадии (1) и (2)).

Для создания клеток Е. coli, способных осуществлять полный биосинтез астаксантина, Ванг и сотр. клонировали некоторые гены из других бактерий в плазмиды, позволяющие получать высокий уровень экспрессии в Е. coli. Это был ген crtE из Erwinia uredovora, кодирующий фермент,

ответственный за проведение стадии (3), а также гены crtB, crtl, crtY, crtZ и crtW из Agrobacterium aurantiacum, кодирующие ферменты для стадий (4), (5), (6), (7) и (8) соответственно.

Был также клонирован ген gps из Archaeoglobus fulgidus, добились высокого уровня экспрессии этого гена в Е. coli и выделили продукт. При взаимодействии этого экстракта с [¹⁴С] изопренилфосфатом, [¹⁴С] диметилаллилпирофос- фатом, [¹⁴С] геранилпирофосфатом или фарнезилпирофосфатом всегда образовывался только [¹⁴С] геранилгеранилпирофосфат.

д) На основании этих данных определите, какую стадию (стадии) метаболического пути катализировал фермент, закодированный геном gps? Поясните свой ответ.

Далее Ванг и сотр. сконструировали несколько вариантов Е. coli с повышенной экспрессией различных генов и определяли интенсивность оранжевого окрашивания колоний (колонии клеток Е. coli дикого типа не имеют оранжевой окраски) и количество образовавшегося астаксантина. Эти результаты представлены ниже.

НО — не обнаружен.

е) Сравните результаты для штаммов 1-4 с результатами для штаммов 5-8 и сделайте заключение об уровне экспрессии фермента, катализирующего стадию (3) в синтезе астаксантина в штамме Е. coli дикого типа. Объясните свой ответ.

ж) На основании представленных данных сделайте вывод о том, какой из ферментов лимитирует скорость этого метаболического пути — IPP-изомераза или фермент, закодированный геном idi? Объясните свой ответ.

з) Каким был бы уровень экспрессии астаксантина в штамме с повышенным уровнем экспрессии crtBIZYW, gps и crtE (низким (+), средним (++) или высоким (+++), если оценивать по интенсивности оранжевой окраски)? Поясните свой ответ.