Основы биохимии Том 1 - А. Ленинджер 1985
Биомолекулы
Вода
Электрофорез на бумаге позволяет разделять аминокислоты в соответствии с их электрическим зарядом
Простейшим методом разделения аминокислот служит электрофорез на бумаге (рис. 5-13). Каплю водного раствора, содержащего смесь аминокислот, наносят на полоску фильтровальной бумаги, смоченную буфером с данным значением pH. Далее к этой полоске прикладывают высокое напряжение, создающее сильное электрическое поле. Из-за различий в величинах рК' аминокислоты перемещаются вдоль полоски в том или ином направлении и с разными скоростями в зависимости от pH буферной системы и приложенного напряжения. Например, при pH 1,0 гистидин, аргинин и лизин несут заряд +2 и движутся к отрицательно заряженному катоду быстрее остальных аминокислот, заряд которых равен +1. С другой стороны, при pH 6,0 положительно заряженные аминокислоты (лизин, аргинин и гистидин) движутся к катоду, а отрицательно заряженные (аспарагиновая и глутаминовая кислоты) - к аноду. Все остальные аминокислоты либо остаются на месте их нанесения, либо перемещаются лишь на незначительные расстояния, так как кроме а-аминогруппы и а-карбоксильной группы у них нет других ионизируемых групп; поэтому изоэлектрические точки всех этих аминокислот практически не различаются. Об этом свидетельствуют величины рК'1 и pK'2, приведенные в табл. 5-4. Чтобы установить положение разделенных аминокислот на электрофореграмме, полоску бумаги высушивают, опрыскивают нингидрином (см. ниже) и нагревают. Синие или лиловые пятна, проступающие на бумаге, указывают на присутствие той или иной аминокислоты. При тех же условиях проводят электрофорез известных образцов аминокислот, которые служат «маркерами», позволяющими определить характерное для каждой аминокислоты положение на электрофореграмме (см. рис. 5-13).
Рис. 5-13. Разделение аминокислот методом электрофореза на бумаге. На полоску бумаги наносят каплю раствора, содержащего смесь аминокислот. Ей дают высохнуть, после чего эту полоску бумаги смачивают буфером с заданным значением pH и помешают между охлаждающими пластинами. Концы полоски погружают в кюветы с электродами и включают высокое напряжение. В возникающем при этом постоянном электрическом поле аминокислоты разделяются в соответствии с их суммарным электрическим зарядом при выбранном pH. Аминокислоты, которые при этом значении pH представляют собой катионы, мигрируют к катоду (отрицательному полюсу), а аминокислоты, имеющие форму анионов, перемещаются к аноду (положительному полюсу), как это показано на схеме, изображающей электрофореграмму в момент времени T1. В конце процесса (на схеме в момент времени Т2) бумагу высушивают, опрыскивают нингидрином и нагревают, в результате чего на бумаге проступают пятна, соответствующие расположению различных аминокислот, которые можно идентифицировать путем сравнения их положения с положением аутентичных аминокислот, используемых в качестве «свидетелей».