Биохимия человека Том 1 - Марри Р. 1993
Биоэнергетика и метаболизм углеводов и липидов
Физиологически важные липиды
Методы разделения и идентификации липидов, содержащихся в биологическом материале
Старые методы разделения и идентификации липидов, основанные на классических операциях кристаллизации, перегонки и экстракции, в настоящее время в существенной степени дополнены хроматографическими методами. Особенно полезно применение тонкослойной хроматографии для разделения различных классов липидов и газо-жидкостной хроматографии (рис. 15.32) для разделения индивидуальных жирных кислот. Предварительной стадией при использовании этих методов является экстракция липидов системой растворителей — чаще всего смесью хлороформа и метанола (2:1).
Рнс. 15.32. Схема газожидкостного хроматографа и полученное с его помощью разделение длинноцепочечных жирных кислот (в виде метиловых эфиров); часть хроматограммы показана справа.
Газо-жидкостная хроматография приводит к физическому разделению пропускаемой газовой фазы путем адсорбции ее компонентов на стационарной фазе, состоящей из инертного твердого носителя, например силикагеля, или инертных гранул размолотого жаропрочного кирпича, покрытых нелетучей жидкостью (например, смазочным жиром или силиконовым маслом). На практике применяют металлические или стеклянные колонки, заполненные указанным выше сорбентом; смесь метиловых эфиров жирных кислот в газообразном состоянии пропускают через колонку, по всей длине которой поддерживается температура 170—225° С (рис. 15.32). Постоянный поток инертного газа — аргона или гелия — увлекает за собой газообразные эфиры. В соответствии с общими принципами хроматографии разделение эфиров жирных кислот основано на различном сродстве компонентов газовой смеси к материалу стационарной фазы. Газы, имеющие большее сродство к стационарной фазе, движутся вдоль колонки медленнее и появляются на выходе из колонки позднее, чем те, которые имеют относительно меньшее сродство. По мере выхода из колонки индивидуальных эфиров жирных кислот они автоматически регистрируются физическими или химическими методами в виде серии пиков, распределенных во времени в соответствии с эффективностью их удерживания стационарной фазой (рис. 15.32). Площадь под пиком пропорциональна концентрации каждого из компонентов смеси. Идентификация каждого компонента производится путем сравнения с хроматограммой стандартной газовой смеси известного состава.
Рис. 15.33. Разделение основных классов липидов с помощью тонкослойной хроматографии. В качестве системы растворителей пригодна система гексан-диэтиловый эфирмуравьиная кислота (в отношении 80:20:2 по объему).
Рис. 15.34. Образование липидных мембран, мицелл, эмульсий и липосом из амфипатических липидов, например фосфолипидов.
Преимущества газо-жидкостной хроматографии состоят в высокой чувствительности, позволяющей разделять очень малые количества смеси, и возможности многократного использования колонки. С помощью этого метода в составе природных жиров обнаружено большое число ранее не идентифицированных жирных кислот.
Тонкослойная хроматография осуществляется на стеклянных пластинках, покрытых тонким слоем суспензии адсорбента, чаще всего силикагелем. После высыхания суспензии пластинки прокаливают в печи заданное время при определенной температуре. Далее на охлажденную «активированную» пластинку наносят смесь липидов в подходящем растворителе. После испарения растворителя край пластинки, ближайший к нанесенному пятну, погружают в смесь соответствующих растворителей, далее пластинку «проявляют» в замкнутой камере, пока растворитель не достигнет противоположного края пластинки. Затем пластинку высушивают для удаления растворителя и определяют положение пятен либо путем их «обугливания» (обработка серной кислотой с последующим нагреванием), либо по флуоресценции (после обработки дихлорфлуоресцеином), либо путем обработки парами иода (рис. 15.33).