Биохимия человека Том 1 - Марри Р. 1993
Структура и функции белков и ферментов
Пептиды
Методы разделения пептидов
Хроматография и высоковольтный электрофорез
Эти методы (гл. 3) применимы для разделения не только аминокислот, но и низкомолекулярных полипептидов.
Гель-фильтрация
При автоматическом секвенировании (определении аминокислотной последовательности) используют крупные (30—100 остатков) пептиды. Однако многие денатурированные высокомолекулярные полипептиды оказыватся нерастворимыми. Это связано с тем, что гидрофобные остатки, ранее укрытые внутри молекулы, при денатурации могут экспонироваться. Такие полипептиды можно в принципе растворить в мочевине, спиртах, органических кислотах и основаниях, но это ограничивает возможности последующего разделения пептидов с помощью ионообменной хроматографии. Впрочем, гель-фильтрацию крупных гидрофобных пептидов можно проводить в 1—4 М муравьиной или уксусной кислоте (рис. 4.7).
Рис. 4.6. Первичная структура ß-липотропина. Фрагмент, включающий остатки 41—58. соответствует меланоцитстимулирующему гормону (ß-MCT), а фрагмент, состоящий из остатков 61—91, включает последовательности указанных эндорфинов.
Жидкостная хроматография на колонках с обращенной фазой при высоком давлении
Мощным методом очистки высокомолекулярных неполярных пептидов является жидкостная хроматография при высоком давлении на неполярных материалах с использованием для элюирования полярных растворителей. Рис. 4.8 иллюстрирует разделение с помощью этого метода тех же бромциановых фрагментов фетального глобина человека, которые фигурировали на рис. 4.7. Совместно используя гель-фильтрацию и указанный метод, можно разделить сложные смеси пептидов, полученные путем частичного протеолиза. Для разделения крупных пептидов созданы новые стационарные фазы.
Высоковольтный электрофорез на молекулярных ситах
В этом методе используются одновременно и разделение по заряду, и эффект молекулярного сита. В качестве сита применяют крахмал и агарозу, а также полимер акриламида (СН2 = CH∙СОNН2) с поперечными сшивками. Если электрофорез проводится в полиакриламидном геле (ПАГ), то раствор белка наносят на насыщенные буфером блоки полиакриламида, «прошитого» метиленбисакриламидом («бис») (степень сшивания 2—10%) или другим аналогичным сшивающим реагентом. Для проявления используют кумасси синий или Ag+ (полипептиды), бромистый этидий (полинуклеотиды) и т.д. Весьма распространено использование электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Белок прогревают и затем проводят электрофорез в присутствии денатурирующих агентов — мочевины или додецилсульфата натрия (ДСН), чтобы создать условия, благоприятные для разделения молекул по размеру. Электрофорез в ПАГ-ДСН широко используется для определения молекулярной массы белковых субъединиц; метод основан на сравнении их подвижности с подвижностью стандартных препаратов известной молекулярной массы.