Биохимия человека Том 1 - Марри Р. 1993

Структура и функции белков и ферментов
Ферменты: общие свойства
Применение эндонуклеаз рестрикции в диагностике

Диагностика генетических заболеваний получила мощный стимул благодаря последним достижениям в технологии рекомбинантных ДНК. Уже давно известно, что все наследственные болезни обусловлены изменениями в ДНК, однако методы прямого определения нуклеотидной последовательности ДНК появились лишь в последнее время. Например, на основе гибридизационного поиска фрагментов ДНК (Southern, 1975) удалось разработать достаточно чувствительный метод пренатального скрининга наследственных нарушений; с этой целью с помощью ферментов рестрикции проводят картирование ДНК, извлеченной из зародышевых клеток, находящихся в амниотической жидкости.

Таблица 7.3. Основные ферменты сыворотки, используемые в клинической диагностике. Многие из приведенных ферментов не являются специфичными для указанных в таблице заболеваний; дополнительные данные об условиях, при которых активность этих ферментов изменяется, приведены в Приложении

В принципе можно сконструировать пробы ДНК для диагностики большей части генетических заболеваний. Например, для пренатального выявления талассемии (нарушения в синтезе субъединиц гемоглобина; см. гл. 6) можно синтезировать пробу ДНК по фрагменту гена, кодирующего нормальную субъединицу гемоглобина, и с ее помощью выявить укорочение или отсутствие рестрикционного фрагмента, обусловленное делецией в этом гене. Именно такие делеции характерны для некоторых видов а-талассемии и нескольких редких типов ß- и ß, δ- талассемии (Dozy, Forman, Abuelo, 1979; Kan, Chang, Dozy, 1982). Предложен и альтернативный подход, основанный на конструировании синтетической кДНК, гибридизующейся с ß-глобиновой последовательностью, которая содержит нонсенсмутацию, характерную для некоторых видов ß- талассемии (Pirastu et al., 1984). Отсутствие в плазме а, -антитрипсина — ингибитора протеаз — приводит к развитию эмфиземы и раннему циррозу печени. Неактивный а,-антитрипсин был обнаружен с помощью ДНК-зонда, сконструированного на основе неактивного мутантного аллеля гена а, -антитрипсина (Kidd et al., 1983).

Гибридизационные зонды могут использоваться также для обнаружения генетических изменений, ведущих к потере рестрикционного сайта (см. гл. 38). Например, при серповидноклеточной анемии наблюдается точечная мутация в кодоне GAG (Glu), в результате которой появляется кодон GTG (Val); такую мутацию в ß-глобиновом гене можно обнаружить, взяв для анализа всего 10 мл амниотической жидкости и используя эндонуклеазу рестрикции Mst II или Sau I (Orkin et al., 1982).

ДНК-зонды можно использовать и для обнаружения последовательностей ДНК, прочно сцепленных с интересующим нас геном, но не принадлежащих самому этому гену. Подобный анализ может применяться и для выявления хромосомного полиморфизма (различий в последовательностях гомологичных хромосом). Расщепление ДНК эндонуклеазой рестрикции дает в таких случаях неодинаковые рестрикционные карты (наборы фрагментов ДНК), свидетельствующие о различиях в последовательностях оснований гомологичных генов. Это явление получило название полиформизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). При рестрикционном анализе обнаруживаются две гибридизационные полосы (если бы гены были идентичны, наблюдалась бы только одна полоса). У потомков, унаследовавших дефектную хромосому, тоже выявляется одна гибридизационная полоса, но ее положение отличается от положения полосы нормальных хромосом. Феномен ПДРФ применялся и для обнаружения гена серповидноклеточной анемии (сцепленного с сайтом рестрикции Нра I), а также ß-талассемии (сцепленного с сайтами рестрикции Hind III и Bam HI) (Little et al., 1980; Woo et al., 1983).

Скрининг, основанный на полиморфизме рестрикционных фрагментов, использовался также для ранней диагностики фенилкетонурии (Woo et al., 1983) (см. гл. 31). Отметим, однако, что сам ген, ответственный за фенилкетонурию, не влияет на распределение рестрикционных фрагментов, однако он тесно сцеплен с сайтом рестрикционного полиморфизма. Перспективы использования полиморфизма рестрикционных фрагментов могут быть связаны с поисками генов, ответственных за то или иное заболевание, которые сцеплены с полиморфным участком. Этот подход уже применялся для скрининга мутаций, приводящих к развитию ретинобластомных опухолей (Cavenee et al., 1983) и болезни Гентингтона (Gusella et al., 1984).

Дальнейшие примеры использования рестрикционных фрагментов в целях диагностики будут даны в гл. 36.

Литература

Общая энзимология

Boyer Р. D.. Lardy Н., Myrhäck К. (eds.) The Enzymes, 3rd ed., 7 vols. Academic Press, 1970—1973.

Nord F.F. (ed.) Advances in Enzymology, Interscience. [Issued annually.]

Структура ферментов

Fersht A. Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed., Freeman, 1985.

Hirs С. H. W., Timascheff S. N. (eds.) Enzyme structure. Parts A — H. In: Methods in Enzymology, Vol. 11, 1967; Vols 25 and 26, 1972; Vol. 27, 1973; Vol. 47, 1977; Vols. 48 and 49, 1978; Vol. 49. 1979. Academic Press.

Коферменты

McCormick D. B., Wright L. D. (eds.) Vitamins and coenzymes, Parts A — F. In; Methods in Enzymology, Vol. 18A, 1970; Vols 18B and 18C, 1971; Vol. 62, 1979; Vols 66 and 67, 1980. Academic Press.

Номенклатура

Enzyme Nomenclature, 1978. Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry op the Nomenclature and Classification of Enzymes, Academic Press, 1979.

Оценка содержания и очистка ферментов

Bergmeyer H.-U. (ed.). Methods of Enzymatic Analysis, 2nd English ed. 4 vols. Academic Press, 1974.

Boyer P. D)., Lardy H., Myrbäck К. (eds.). The Enzymes, 3rd ed. 7 vols, Academic Press, 1970—1973.

Colowick S. P., Kaplan N. O. (eds.). Methods in Enzymology, 69 vols, Academic Press, 1955—1987.

Hoffmann-Ostenhoff O. et al. Affinity Chromatography. Pergamon Press, 1978.

Jacoby W. B. (ed.) Enzyme purification and related techniques. In: Methods in Enzymology, Vol. 22, Academic Press, 1971.

Jacoby W. B., Wilchek M. (eds.). Affinity techniques. In: Methods in Enzymology, Vol. 34, 1974; Vol. 46, 1977, Academic Press.

Mosbach К. (ed.). Immobilized enzymes. In: Methods in Enzymology, Vol. 44, Academic Press, 1976.

Внутриклеточное распределение ферментов

De Pierre J. W., Ernster L. Enzyme topology of intracellular membranes, Annu. Rev. Biochem., 1977, 46, 201.

Клиническая энзимология

Bergmeyer H. U. Aspartate aminotransferase, Test of the Month 6, 1980, No. 2.

Bergström К. Determination of serum alkaline phosphatase activity, Test of the Month 1, 1974, No. 22.

Cavanee W. K. et al. Expression of recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastomas. Nature, 1983, 305, 779.

Dozy A. M., Forman E. N., Abuelo D. N. Prenatal diagnosis of homozygous a-thalassemia, JAMA, 1979, 241, 1610.

Fishinger A. F. Creatine phosphokinase and its izoenzymes, Test of the Month 2, 1976, No. 6.

Gusella J. F. et al. DNA markers for nervous system diseases, Science, 1984, 225, 1320.

Kan Y. W., Chang J., Dozy A. M. Pages 275—283. In: Thalassemia: Recent Advances in Detection and Treatment, Cao A., Carcassi U., Rowley P. (eds.), A. R. Liss, 1982.

Kidd V.J. et al. a1-Antitrypsin deficiency detection by direct analysis of the mutation in the gene, Nature, 1983, 304, 230.

Little P. F. R. et al. Model for antenatal diagnosis of ß-thalassemia and other monogenic disorders by molecular analysis of linked DNA polymorphisms. Nature, 1980, 285, 144.

McNair R.D. Lactate dehydrogenase. Test of the Month 2, 1976, No. 3.

Orkin S. H. et al. Improved detection of the sickle mutation by DNA analysis: Application to prenatal diagnosis, N. Engl. J. Med., 1982, 307, 32.

Pirastu M. et al. Multiple mutations produce δß0-thalassemia in Sardinia, Science, 1984, 223, 929.

Southern E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis, J. Mol. Biol., 1975, 98, 503.

Wilkinson J. H. Clinical applications of isozymes, Clin. Chem., 1970, 16, 733.

Wilkinson J. H. Clinical significance of enzyme activity measurements, Clin. Chem., 1970, 16, 882.

Woo S. L. C. et al. Cloned human phenylalanine hydroxylase gene allows prenatal diagnosis and carrier detection of classical phenylketonuria, Nature, 1983, 306, 151.