Биохимия аминокислот - А. Майстер 1961

Общая биохимия и физиология аминокислотного обмена
Функции витамина В6 в обмене аминокислот

Между отдельными аминокислотами и витаминами существуют важные метаболические взаимоотношения. Роль рибофлавина в виде рибофлавинфосфата и флавинадениндинуклеотида отмечена выше (стр. 183). Аскорбиновая кислота участвует в окислении n-оксифенилпировиноградной кислоты в гомогентизиновую, но механизм ее действия остается пока не выясненным (стр. 419). Взаимоотношения между триптофаном и никотиновой кислотой будут обсуждены детально в одном из последующих разделов (стр. 399). Биотин, по-видимому, принимает участие во включении СО₂ (через щавелевоуксусную кислоту) в молекулу аспарагиновой кислоты (стр. 312). Наличие ε-биотиниллизина в биологических объектах указывает на наличие связи между биотином и обменом лизина. Установлено также значение кофермента А в различных реакциях обмена веществ. (В образовании самой молекулы кофермента А участвуют несколько аминокислот (стр. 365).) Кофермент А принимает участие в диссимиляции углеродной цепи лейцина, изолейцина и валина, в синтезе некоторых ацилпроизводных аминокислот (например, гиппуровой кислоты) и, вероятно, в некоторых других превращениях аминокислот. Значение фолевой кислоты в обмене одноуглеродных остатков будет рассмотрено в гл. IV.

Витамин В6 в виде пиридоксальфосфата или пиридоксаминфосфата участвует во многих реакциях обмена аминокислот (табл. 24) и играет в них исключительно важную и многообразную роль.

Таблица 24 Реакции, протекающие с участием витамина В₆

Сведения о существовании витамина В₆ были впервые получены в 1934 г. [385], когда было показано, что этот витамин является необходимым пищевым фактором для крыс; однако его функции в обмене веществ выяснены лишь недавно. Несмотря на большое количество накопленных о витамине B₆ сведений, совокупность симптомов, наблюдаемых при его недостаточности, до сих пор полностью не объяснена. Осуществление химического синтеза витамина В₆ и обнаружение трех природных форм этого витамина создали предпосылку для дальнейших открытий; в первую очередь было установлено его участие в ферментативном переаминировании и декарбоксилировании аминокислот.

Теперь общепризнано, что механизм ферментативного переаминирования заключается, в обратимом образовании шиффовых оснований из амино (или кето) кислоты и фосфорного эфира пиридоксаля (или пиридоксамина). За несколько лет до открытия Браунштейном и Крицман [251] ферментативного переаминирования Хербст [249, 250] выдвинул предположение о наличии подобного механизма для объяснения неферментативного переаминирования между этиловыми эфирами а-аминофенилуксусной кислоты и пировиноградной кислоты:

Сходная схема была предложена Браунштейном [257] для объяснения ферментативного переаминирования:

Обнаружение в природных объектах альдегидной и аминной форм витамина В6 привело Снелла [386] к предположению, что взаимопревращение этих форм витамина В₆ происходит путем переаминирования и что витамин В₆ может выполнять функцию кофермента при ферментативном переаминировании. Позже Снелл [387] доказал обратимое взаимопревращение пиридоксаля и пиридоксамина в результате реакций неферментативного переаминирования с амино- и кетокислотами. Экспериментальные данные, подтверждающие участие витамина В₆ в ферментативном переаминировании, были получены при исследовании крыс и микроорганизмов в условиях недостаточности витамина В₆. Недостаточность витамина В₆ сопровождалась снижением уровня активности трансаминазы, добавление же пиридоксальфосфата к препаратам тканей или клеток восстанавливало активность фермента [388—390].

Аналогичные результаты были получены при исследовании процессов декарбоксилирования аминокислот. Было найдено, что активность тирозиндекарбоксилазы в клетках Streptococcus faecalis зависит от наличия пиридоксина в среде [383, 391]. Позднее установили, что добавление пиридоксаля вместе с аденозинтрифосфатом или же пиридоксальфосфата к клеткам 5. faecalis, выросшим на среде с недостаточным содержанием витамина В₆, повышает активность этой декарбоксилазы. Препарат кофермента декарбоксилазы, выделенный из дрожжей [392], по условиям стабильности и по способности активировать декарбоксилазу оказался сходным с препаратом синтетического пиридоксальфосфата [393—396]. Был обнаружен термостабильный кофактор трансаминазы, который также оказался сходным с пиридоксальфосфатом и мог быть заменен им [208, 257, 397]. Существуют убедительные данные, показывающие, что пиридоксальфосфат участвует в декарбоксилировании аминокислот и что в трансаминировании могут принимать участие как пиридоксальфосфат, так и пиридоксаминфосфат. Эти данные получены при исследовании различных В₆-авитаминозных организмов, а также в опытах, касающихся влияния добавленных синтетических коферментов на ферментные системы in vitro.

Интересный опыт был поставлен Снеллом и его сотрудниками [398]. Они выращивали различные микроорганизмы на среде, недостаточной по витамину В₆, но содержавшей необходимые аминокислоты. При этом оказалось, что Streptococcus faecalis может расти на среде с недостаточным содержанием витамина В₆ при наличии в ней незаменимых аминокислот, но прекращает рост при замене этих аминокислот соответствующими а-кетокислотами. Рост на средах с а-кетокислотами наблюдается лишь при добавлении к среде достаточного количества витамина В₆. Следовательно, в этих условиях роль витамина B6 сводится к обеспечению трансаминаз коферментом. Аналогичные исследования были проведены в отношении D-аланина: были найдены условия, при которых добавляемый к среде витамин В6 необходим лишь для обеспечения аланинрацемазы коферментом (см. стр. 241).

Сродство к витамину В₆ у различных ферментных препаратов неодинаково. Об этом свидетельствуют данные исследований, в которых изучалось активирование изолированных апоферментов, и опыты по определению влияния недостаточности витамина В₆ на активность ферментов в тканях. Так, например, при недостаточности витамина В₆ у крыс снижается активность глутамат-аспартат-трансаминазы [388, 390, 399, 400] и глутамат-аланин-трансаминазы [401, 403] в ткани, тогда как активность глутамин-а-кетокислотной трансаминазы остается без изменений [402]1. Зависимость последней от витамина В₆ была подтверждена путем получения частично отделенного от кофермента экстракта апофермента из печени крыс после введения им изоникотинилгидразида [404]. Ряд исследований показывает, что изоникотинилгидразид действует как антагонист витамина В6 [404—408]. Так, больные, получающие изоникотинилгидразид, выделяют с мочой большие количества витамина В₆, по-видимому, в виде соответствующего гидразона. Эти данные свидетельствуют о том, что действие гидразида объясняется его способностью соединяться с альдегидной группой пиридоксаля. При определенном уровне недостаточности витамина В₆ у крыс активность цистеинсульфинат-пируват-трансаминазы в печени снижается по сравнению с контролем, тогда как активность цистеинсульфинат-а-кетоглутарат- и глутамат-пируват-транс-аминазы не уменьшается [409]. При диализе препаратов из печени крысы цистеиндесульфгидраза печени легко диссоциирует на апо- и кофермент; активность этой ферментной системы снижается уже при умеренной недостаточности витамина В₆ [400, 402].

Хотя пиридоксальфосфат уже в 1944 г. рассматривали как кофермент трансаминаз и декарбоксилаз, это соединение, а также пиридоксаминфосфат были получены в чистом виде лишь в 1952 г. Положение фосфатной группы в коферменте было точно установлено также в 1952 г., хотя из данных более ранних исследований были сделаны правильные выводы относительно строения его молекулы.

¹ По данным Оленичевой [294], у крыс при алиментарном B6-авитаминозе легко удается наблюдать глубокое подавление активности трансаминазы глутамина и трансаминазы аспарагина. — Прим. ред.

Пиридоксаль-3-фосфат, однозначный синтез которого был осуществлен Каррером и Висконтини [410], оказался не идентичным биологически активному продукту [411]. Другие исследования давали основание полагать, что фосфатная группа присоединена в положении 5 [412, 413]; наконец, однозначный синтез пиридоксаль-5-фосфата, осуществленный Бэддили и Мэтиасом [414], окончательно выяснил этот вопрос. Несомненно, что и при более ранних синтезах также были получены пиридоксаль-5-фосфат и пиридоксамин-5-фосфат, однако лишь последующие работы Каррера и сотрудников [415, 416] и Питерсона и Собера [417, 418] позволили получить чистые препараты этих соединений. Питерсон и Собер приготовили, кроме того, пиридоксин-5-фосфат, действуя на пиридоксамин-5-фосфат азотистой кислотой. Получены также 4-дезоксипиридоксин-5-фосфат, ω-метилпиридоксамин-5-фосфат и ω-метилпиридоксаль-5-фосфат [417, 419, 420].

Трансаминазы в отличие от прочих ферментов, содержащих витамин В₆, характеризуются тем, что роль кофермента может выполнять как пиридоксаминфосфат, так и пиридоксальфосфат, тогда как в реакциях декарбоксилирования, рацемизации и в других реакциях, катализируемых В₆-ферментами, витамин В₆ проявляет каталитическое действие только в форме пиридоксальфосфата. Ранние исследования давали некоторое основание считать, что глутамат-аспартат-трансаминаза сердца свиньи активируется лишь пиридоксальфосфатом (но не пиридоксаминфосфатом) [263, 421]. Однако позднее было показано, что в данной системе активны оба кофермента [422]; в последующих работах найдено, что оба кофермента могут активировать и другие системы трансаминирования. Весьма интересно, что для проявления максимальной активности необходимо предварительное инкубирование фермента с коферментом до добавления субстрата (очевидно, требуется некоторое время для присоединения кофермента к ферменту). Для максимального активирования фермента пиридоксаминофосфатом необходима более длительная предварительная инкубация, чем при применении пиридоксальфосфата; это указывает на то, что аминная форма соединяется с белком фермента медленнее. Имеющиеся данные позволяют исключить возможность предварительного превращения пиридоксаминфосфата в пиридоксальфосфат в условиях данного эксперимента. Кофермент, очевидно, вступает с ферментом в прочную связь. Даже при многодневном диализе транс-аминазы, реконструированной с помощью пиридоксальфосфата или пиридоксаминфосфата, активность фермента не уменьшалась [422].

Механизм ферментативного переаминирования может быть выражен следующими уравнениями (ПЛФ и ПМФ обозначают соответственно пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат)

Попытки непосредственно показать взаимопревращение пиридоксаминфосфат-фермент а и пиридоксальфосфат-фермента до сих пор были безуспешными1, по-видимому, вследствие ряда экспериментальных трудностей, обусловленных тем, что в соединение с ферментом вступает лишь очень небольшое количество кофермента и при этом отсутствует достаточно хороший метод количественного отщепления и определения связанного с ферментом кофермента. Задача осложняется еще и тем, что добавленный синтетический кофермент может присоединяться к белковой молекуле фермента не только там, где он необходим для проявления ферментативной активности, но и в других ее участках. Исследования с применением кофермента, меченного радиоактивным фосфором, позволили обнаружить неспецифическое связывание значительного количества кофермента, обусловленное (по крайней мере отчасти) образованием шиффовых оснований из кофермента и свободных аминогрупп белка.

¹ Это взаимопревращение убедительно доказано в опытах с высокоочищенным препаратом глутамат-аспартат-трансаминазы [W. Т. Jenkins, J. W. Sizer, J. Am. Chem. Soc., 79, 2655 (1957); J. Biol. Chem., 235, 62Ó (i960)]. — Прим. ped.

Образование пиридоксальфосфата из пиридоксаля и аденозинтрифосфата впервые исследовали Ганселус и сотрудники [393, 396] с применением тирозиндекарбоксилазной системы Streptococcus faecalis. Пиридоксалькиназа недавно выделена из дрожжей [423]; найдено, что она катализирует следующую реакцию:

Этот фермент, для действия которого необходимо присутствие ионов металла (например, Со⁺⁺, Mg⁺⁺, Fe⁺⁺), широко распространен; помимо дрожжей, он найден также у Escherichia coli [423], в мозге [424] и в печени [425]. Система фосфорилирует пиридоксаль, пиридоксамин, пиридоксин, 4-дезоксипиридоксин и ряд других аналогов витамина В₆. Найдено, что 4-дезоксипиридоксин тормозит тирозиндекарбоксилазу Streptococcus faecalis; торможение, по-видимому, обусловлено конкуренцией указанного аналога витамина В₆ с фосфопиридоксалем за аподекарбоксилазу [426—428]. Инкубирование глутамат-аспартат-трансаминазы сердца свиньи с 4-дезоксипиридоксинфосфатом препятствует активированию фермента при последующем инкубировании с пиридоксаминфосфатом или пиридоксальфосфатом [422]. Однако после полного реактивирования апотрансаминазы путем инкубирования с одним из двух коферментов 4-дезоксипиридоксин уже не оказывает тормозящего действия. Аналогичные результаты были получены с пиридоксинфосфатом, который не проявляет активности в качестве кофермента трансаминазы, но оказывает тормозящее действие примерно того же характера и той же степени, что и 4-дезоксипиридоксин_: фосфат. Тормозящее действие пиридоксинфосфата указывает на возможность торможения трансаминазы в тканях в результате восстановления формильной группы пиридоксальфосфата, входящего в состав молекулы фермента; к инактивированию может приводить также окисление связанного кофермента в фосфорный эфир пиридоксиловой кислоты.

ω-Метилпиридоксаль и ω-метилпиридоксамин могут обеспечивать рост S. faecalis взамен витамина В6 в условиях, когда аминокислоты синтезируются из соответствующих а-кетокислот; это дало основание предположить, что фосфорилированные ω-метилпроизводные витамина В₆ могут проявлять активность в качестве коферментов трансаминаз. Позднее было показано, что ω-метилпиридоксальфосфат активирует трансаминазы S. faecalis, однако сродство апоферментов к аналогу ниже, чем к естественному коферменту [429]. Весьма интересно, что замещение метильной группы пиридоксаля этильной группой не сопровождается полной потерей активности. В системе аланинрацемазы активность ω-метилпиридоксальфосфата значительно ниже, чем пиридоксальфосфата, а в системе цистеиндесульфгидразы он, по-видимому, совсем лишен активности.

ω-Метилпроизводные витамина В₆ в отличие от множества других аналогов витамина В₆ [430—433] оказывают некоторое стимулирующее действие на рост в отсутствие витамина В₆. Так, (ω-метилпиридоксаль, ω-метилпиридоксин и ω-метилпиридоксамин не только действуют как факторы роста для бактерий [429], но и способствуют росту крыс, получающих рацион с недостаточным содержанием витамина В₆. Однако через несколько недель скорость роста снижается до величин, близких к скорости роста контрольных (авитаминозных) животных или даже более низких. Результаты этих исследований можно объяснить тем, что ω-метилпиридоксальфосфат способен действовать как антагонист в одних ферментных системах и как активатор — в других [434].

Представление о том, что механизм ферментативного переаминирования включает обратимое образование шиффовых оснований с участием альдегидной и аминной формы витамина В₆, сложилось на основании изучения неферментативных реакций переаминирования между амино- и кетокислотами [249, 250] и дальнейшего развития этих исследований в опытах с пиридоксалем и пиридоксамином. Было найдено, что многие аминокислоты вступают в реакции неферментативного переаминирования с пиридоксалем в присутствии ионов меди, железа или алюминия при 100°, причем эта реакция оказалась обратимой [387, 435—437]:

Реакция между пиридоксалем и аланином была изучена довольно подробно, и спектрофотометрическим методом установлено образование двух шиффовых оснований в качестве промежуточных продуктов [438]. При помощи хроматографии на бумаге осуществлено разделение этих промежуточных соединений [439]. Менее успешными были попытки обнаружить действие ионов металла при следующей реакции [436]:

Согласно некоторым данным, эта реакция в известной мере активируется солями алюминия и железа. Потребность в ионе металла при неферментативном переаминировании была установлена для нескольких систем, однако для реакции между глиоксиловой кислотой и аминокислотами, легко протекающей при 25°, ионы металлов, по-видимому, не нужны [291]. Участие металлов в ферментативном переаминировании не установлено.

Представление об образовании шиффовых оснований при реакциях переаминирования согласуется с данными об обмене дейтерия при этих реакциях [257, 260, 440—443]. В молекуле глутаминовой кислоты, образующейся при ферментативном переаминировании между а-кетоглутаровой и аспарагиновой кислотами в присутствии D₂О, содержится около одного атома дейтерия [440, 444]. Водород аспарагиновой кислоты также замещается дейтерием в процессе ферментативного переаминирования. Обмен а-водородного атома аминокислот при переаминировании связан, как видно, с действием фермента; если из системы исключить а-кетоглутаровую кислоту, то обменивается менее 6% а-водорода аспарагиновой кислоты. Различными путями установлено, что ß-водородный атом аминокислот не участвует в реакциях переаминирования. В лейцине, выделенном из тканей крыс после скармливания им лейцина, меченного дейтерием в a-, β- и у-положениях, разведение метки водородных атомов в положениях ß и у было почти одинаковым, что указывает на отсутствие заметного обратимого а, ß-дегидрирования [445]. Другое наблюдение, согласующееся с этим выводом, заключается в том, что при обратимом ферментативном трансаминировании между L-изолейцином и а-кетоглутаровой кислотой образуется чистая L-a-кето-β-метилвалерьяновая кислота; в тех же условиях из L-алло-изолейцина образуется D-а-кето-β-метилвалерьяновая кислота [129, 130]. Если бы в процессе переаминирования происходило обратимое дегидрирование в а- и ß-положении, то должна была бы образоваться рацемическая а-кетокислота. Далее, найдено, что ферментативное переаминирование между ß-дейтеро-а-кетоглутаровой кислотой и аланином не сопровождается заметной потерей дейтерия, т. е. количество дейтерия в образующейся глутаминовой кислоте почти равно количеству его в исходной а-кетоглутаровой кислоте [446].

Изотопными методами установлено переаминирование между аминокислотой и соответствующей ей а-кетокислотой [444, 447]. Обнаружено, в частности, переаминирование между аланином и С¹⁴-пировиноградной кислотой и между С¹³-глутаминозой кислотой и а-кетоглутаровой кислотой. Из этих данных следует, что в системе, включающей две а-кетокислоты и аналогичные им аминокислоты, происходят реакции переаминирования между молекулами с идентичной углеродной цепью; за счет этого должны снижаться количества вновь образующихся амино- или кетокислот. Такой эффект снижения скорости переаминирования был установлен экспериментально [448].

Исследования с применением субстратов, меченных N¹⁵, показали, что аммиак не является промежуточным продуктом при ферментативном переаминировании [318], и тем самым окончательно подтвердили первоначальное представление о природе этой реакции [251]. Было найдено, что в среде, содержащей немеченый ион аммония, аминокислоты, меченные N¹⁵, непосредственно передают свою аминогруппу а-кетоглутаровой кислоте [318].

Близкое сходство между реакциями ферментативного и неферментативного переаминирования и обнаружение роли пиридоксальфосфата в качестве кофермента во многих других ферментных системах привели к разработке представлений об общности механизма реакций, катализируемых витамином В6. Мецлер и сотрудники [435] и Браунштейн и Шемякин [449] независимо друг от друга выдвинули одну и ту же, в основных чертах, теорию. Согласно представлениям этих авторов, из пиридоксаля, аминокислоты (и иона металла) образуется шиффово основание; реакции, катализируемые витамином В₆, интерпретируются как результат различных последовательных перемещений электронов в молекулах промежуточных соединений. Например, Мецлер и сотрудники [435] сформулировали для реакций переаминирования следующий механизм:

Далее, предложена указанная ниже схема реакции рацемизации аминокислот:

Разработаны также схемы механизма декарбоксилирования, отщепления заместителей в ß-положении (дегидратазы серина и треонина, триптофаназа, аллииназа, цистатионаза), присоединения ß-заместигелей (синтез триптофана, образование цистатионина), расщепления y-замещенных аминокислот (десульфгидраза гомоцистеина, дегидратаза гомосерина), синтеза и расщепления треонина (на глицин и ацетальдегид) и серина (на глицин и формальдегид) [435, 449]. Постулировано образование клешневидного комплекса металла с пиридоксалем и аминокислотой в качестве общего промежуточного продукта при целом ряде реакций [435]. Эти механизмы обсуждаются в соответствующих разделах гл. IV. Манделес и сотрудники [246] показали, что при ферментативном декарбоксилировании аминокислот один водородный атом остается связанным с а-углеродным атомом. Они нашли, что в аминах, образуемых при ферментативном декарбоксилировании лизина, глутаминовой кислоты и тирозина в среде, содержащей 99,8% D₂O, на молекулу приходится лишь один атом дейтерия, причем он расположен исключительно у того углеродного атома, который являлся а-углеродом исходной аминокислоты. Обращение реакции декарбоксилирования также сопровождается включением дейтерия [244, 245]. Согласно данным упомянутых авторов, при этом происходит асимметрическое включение дейтерия, приводящее к образованию одного оптического изомера дейтерированного амина. Ханке и сотрудники [450, 451] путем воздействия глутамат-рацемазы на глутаминовую кислоту приготовили а-дейтеро-DL-глутаминовую кислоту. Этот продукт был декарбоксилирован ферментативно в среде Н₂O образованием одного из изомеров

дейтеро-у-аминомасляной кислоты:

Этот изомер не теряет своего дейтерия при обработке глутаматдекарбоксилазой в водном растворе. Другой изомер дейтеро-y-аминомасляной кислоты был получен при декарбоксилировании L-глутаминовой кислоты в среде D₂O; этот изомер в присутствии декарбоксилазы обменивает свой дейтерий на водород воды. Данные, полученные Ханке и его сотрудниками, находятся в согласии с механизмом декарбоксилирования, включающим следующие промежуточные фазы:

Витамин B₆участвует, по-видимому, во всех реакциях переаминирования. То обстоятельство, что некоторые трансаминазы не требуют добавления этого кофермента для обеспечения максимальной активности, объясняется тем, что он в этих случаях прочно связан с ферментом. Не исключена возможность, что реакции переаминирования, в которых участвуют альдегиды (например, глиоксиловая кислота), могут протекать без витамина В₆; такие реакции были осуществлены в неферментативных системах, однако до настоящего времени не получено бесспорных данных, подтверждающих существование трансаминаз, не содержащих витамина В₆. Все аминокислотные декарбоксилазы, которые явились предметом тщательного изучения, также действуют при участии пиридоксальфосфата. Сперва предполагали, что для действия гистидиндекарбоксилазы витамин В₆ не нужен [452], но затем было установлено, что и у этого фермента коферментом является пиридоксальфосфат [453]. Аспартат-β-декарбоксилазу Clostridium welchii удается активировать пиридоксальфосфатом или а-кетокислотами. Активирующее действие а-кетокислот было отнесено за счет реакции переаминирования между этими кислотами и содержащимся в ферментном препарате пиридоксаминфосфатом с образованием пиридоксальфосфата (стр. 208).

Многообразие реакций, для которых необходим витамин В₆, свидетельствует о первостепенном значении этого витамина в процессах обмена аминокислот и дает основание полагать, что при В₆-авитаминозе должны возникать различные нарушения обмена. Опубликована обширная серия исследований над В₆-авитаминозными крысами [454—459]. Помимо ожидаемого изменения активности тканевых трансаминаз, при недостаточности витамина В₆ было отмечено повышенное содержание мочевины в крови и пониженное содержание глутамина в кровяной плазме. Введение L-глутаминовой кислоты и L-лизина приводит к стойкому повышению содержания мочевины в крови.

Истолкование этих фактов затруднительно не только из-за множественности функций витамина В₆, но также ввиду неодинаковой степени сродства различных пиридоксалевых ферментов к коферменту. Интересно отметить, что при определенных условиях возможен рост бактерий в отсутствие добавленного витамина В₆; однако не исключена возможность синтеза небольших количеств витамина микроорганизмами.

Витамин В6, вероятно, участвует и в действии других ферментных систем, помимо описанных выше. Так, например, недавно найдено, что пиридоксальфосфат принимает участие в синтезе гема [460, 706]; это открытие проливает свет на развитие анемии у животных при недостаточности витамина В₆. Вопрос о возможном участии витамина В₆ в процессах переноса аминокислот рассмотрен в первом разделе этой главы.