Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 2 - Д. Мецлер 1980

Организация метаболизма: катаболические пути
Цикл трикарбоновых кислот
Синтез регенерирующегося субстрата оксалоацетата

Первичным субстратом цикла трикарбоновых кислот является ацетил-СоА. Несмотря на то что в биохимической литературе очень часто в качестве субстратов, «входящих» в цикл, рассматриваются оксало-ацетат и его предшественники — сукцинат, фумарат и малат, — эти соединения в цикле трикарбоновых кислот не расходуются. Оксалоацетат полностью регенерируется, почему его и называют регенерирующимся субстратом. Для работы каталитического цикла необходимо, чтобы регенерирующийся субстрат всегда имелся в нужных количествах и чтобы его концентрацию можно было легко увеличить, как только понадобится ускорить ход реакций цикла. В нормальных условиях оксало- ацетат образуется в любых количествах, необходимых для работы цикла трикарбоновых кислот, из фосфоенолпирувата или из пирувата [уравнение (8-2)]; оба эти соединения являются легко доступными продуктами метаболизма сахаров.

В бактериях и зеленых растениях синтез оксалоацетата обеспечивает фосфоенолпируват-карбоксилаза [уравнение (7-79)] — фермент, в сильной степени подверженный регуляторным воздействиям. В животных тканях аналогичную роль играет пируваткарбоксилаза [уравнение (8-2)]. Последний фермент остается почти неактивным в отсутствие аллостерического эффектора ацетил-СоА. По этой причине он оставался незамеченным на протяжении многих лет. При высоких концентрациях ацетил-СоА происходит полная активация фермента, обеспечивающего синтез оксалоацетата в достаточно высоких концентрациях, необходимых для работы цикла. Следует, однако, отметить, что концентрация оксалоацетата в митохондриях очень мала — всего 2∙10^-7 4∙10^-7 М (20—40 молекул на митохондрию) [16].

Дополнение 9-Д

Использование изотопных меток при изучении цикла трикарбоновых кислот

Первое применение изотопных меток при изучении цикла трикарбоновых кислот — вообще одно из первых в истории биохимии — было осуществлено Вудом и Веркманом в Университете штата Айова (США)^а. Их целью было исследование сбраживания глицерина пропионовокислыми бактериями — процесса, не имевшего видимой связи с циклом трикарбоновых кислот:

В ходе брожения наблюдалось образование небольших количеств сукцината. На основе простых измерений баланса брожения было высказано предположение, что СО₂ включается в состав оксалоацетата, который далее восстанавливается в сукцинат. Сообщение об этом появилось в 1938 г. Как мы теперь знаем, этот процесс действительно является необходимой стадией пропионовокислого брожения (разд. Е, 3). В то время еще не было возможности использовать изотоп ¹⁴С, однако с помощью масс-спектрометра, сконструированного Ниром, можно было регистрировать присутствие устойчивого изотопа ¹³С. Вуд и Веркман разработали термодиффузионную колонку для получения бикарбоната, обогащенного изотопом ¹³С, и наладили масс-спектрометр. К 1941 г. было однозначно установлено, что в бактериях двуокись углерода включается в сукцинат^б.

Возникло предположение, что включение СО₂ в сукцинат происходит также в животных тканях, и для проверки этого предположения Вуд исследовал метаболизм препарата печени голубя; при этом для блокирования сукцинатдегидрогеназы был добавлен малонат (дополнение 9-В). К удивлению исследователя накапливающийся сукцинат не содержал изотопа ¹³С. Вскоре, однако, было показано, что СО₂ включается в карбоксильную группу а-кетоглутарата, смежную с карбонильной группой. При последующем превращении в сукцинат этот карбоксил утрачивается (рис. 9-2), что и объясняет отсутствие ¹³С в сукцинате. В историческом плане примечательно, что эти наблюдения были неправильно интерпретированы большинством биохимиков того времени. Они согласились, что цитрат не принимает участия в цикле трикарбоновых кислот.

Поскольку цитрат представляет собой симметричное соединение, считалось, что при включении в цитрат изотопа ¹³С он всегда будет представлен в равном количестве в обеих концевых карбоксильных группах. Тогда ¹³С должен обязательно включаться и в сукцинат. Лишь в 1948 г. Огстон сформулировал представление о том, что при связывании субстрата не менее чем в трех точках ферменты становятся способными к асимметричной атаке симметричных субстратовв. Другими словами, фермент может синтезировать цитрат таким образом, что атомы углерода, поступающие от молекулы ацетил-СоА, будут попадать всегда только в одну из СН₃СООН-групп, окружающих прохиральный центр (гл. 6, разд. Г,2).

В последние годы с помощью различных изотопных меток удалось выяснить полную стереохимию реакций цикла трикарбоновых кислот (гл. 7, разд. К, 2, ж). Некоторые результаты отмечены на рис. 9-2 значками * и ⁺.

^а Wood Н. G. In: The Molecular Basis of Biological Transport (J. F. Woes- sner, Jr. and F. Huijing, eds.), pp. 1—54, Academic Press, New York, 1972.

^б Wood H. G., Werkman С. H., Hemingway A., Nier A. O., JBS, 139, 377—381 (1941).

^в Ogston A. G., Nature (London), 162, 963 (1948).