Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 2 - Д. Мецлер 1980

Ферменты: белковые катализаторы клеток
Механизмы ферментативного катализа
Кислотный и основный катализ

Многие реакции, которые ускоряются ферментами, могут катализироваться также кислотами или основаниями, а часто и соединениями обоих типов. Хорошо изученным примером такого рода является мутаротация — обратимое взаимное превращение а- и ß-аномерных форм сахаров, в частности глюкозы [см. схему (6-75)]. Эта реакция катализируется специфическим ферментом мутаротазой, а также неорганическими кислотами и основаниями. Эти данные показывают, что между простыми кислотами и основаниями, с одной стороны, и ферментами — с другой, есть нечто общее с точки зрения каталитического действия. Поскольку многие боковые цепи аминокислот содержат кислотные и основные группы, мы приходим к вполне естественному заключению, что эти группы должны участвовать в катализе как кислоты и основания. Однако для того чтобы понять, как именно они участвуют в катализе, мы должны иметь представление о численных значениях некоторых констант равновесия и констант скорости.

а. Сильные и слабые кислоты

Кислоты являются донорами протонов, а основания — их акцепторами. Кислота может быть охарактеризована константой диссоциации или взятым с противоположным знаком десятичным логарифмом этой константы рК_а (см. также гл.4, разд В):

где К_а = [Н⁺] [В^-]/[НВ] Заметим, что [Н₊] представляет собой концентрацию (или, точнее говоря, активность) ионов Н₃О⁺, а не свободных протонов. Далее мы будем обозначать кислоты символами НВ или Н+В, а сопряженные основания, образующиеся при диссоциации кислот, — символами В^- или В.

Напомним, что сильные кислоты имеют низкие значения рК_а, а сопряженные основания являются слабыми основаниями. В то же время очень слабые кислоты имеют высокие значения рК_а, а сопряженные основания являются сильными основаниями. При рассмотрении механизмов ферментативных реакций целесообразно знать значения рК_а следующих групп:

Эти значения не являются постоянными и могут быть больше или меньше на 0,5 единицы в зависимости от структуры соединения и окружения данной боковой группы в белке. В некоторых случаях отклонения бывают даже более существенными.

б. Кислотно-основный катализ мутаротации

Процесс мутаротации глюкозы протекает через стадию образования в качестве промежуточного соединения свободной альдегидной формы:

В ходе реакции от ОН-группы при С-1 атоме а-глюкозы отрывается водородный атом и протон (по-видимому, иной) переносится на кислодор кольца с разрывом С—О-связи. Обратный процесс может проходить также по пути б, что ведет к образованию ß-изомера.

Перенос протона (чаще всего между атомами кислорода, азота и серы) происходит в ходе многих биохимических реакций. Связи между атомом водорода, с одной стороны, и атомами кислорода, азота и серы — с другой, обычно сильно поляризованы, что приводит к появлению на водородных атомах небольшого положительного заряда. Таким образом, группы приобретают слабо кислотный характер, и протоны могут сравнительно легко отрываться от них и переноситься на другие группы. Естественно допустить, что каталитические свойства кислот и оснований связаны с подобным переносом водородных атомов.

в. Общий основный и общий кислотный катализ

Катализируемая основанием мутаротация протекает следующим образом: основание, например ОН^--ион, атакует протон гидроксильной группы; в результате последняя превращается в анион и одновременно образуется сопряженная кислота ВН⁺ (стадия а на приведенной ниже схеме):

Анион затем изомеризуется в форму с раскрытым кольцом (стадия б). Присоединение протона (в результате переноса от Н₃О⁺) приводит к образованию свободной альдегидной формы сахара (стадия в).

В роли основания-катализатора в этой схеме может выступать не Только ОН^--ион, но и другие, более слабые основания, например ион аммония или даже вода. Как оказалось, в некоторых случаях скорость каталитической реакции пропорциональна только концентрации ионов ОН^-, а присутствие других, более слабых оснований на этой величине не сказывается. Подобный катализ называют специфическим катализом гидроксильным ионом. В общем случае кажущаяся константа скорости реакции первого порядка (k_obs) для изучаемого процесса представляет собой сумму нескольких членов:

k_obs = k_H2O + k_OH^-[OH^-] + k_B[В].       (6-77)

Член k_H2O характеризует скорость процесса в чистой воде и соответствует каталитическому действию одной воды либо как кислоты, либо как основания. Два последних члена определяют вклад в катализ соответственно ОН^--иона и другого основания. Член k_B[B] характеризует общий основный катализ, который, как полагают, играет важную роль в функционировании многих ферментов. В энзимологии под общим основным катализом подразумевают способность некоторой основной группы в молекуле фермента выполнять роль акцептора протона.

Катализ мутаротации кислотами наблюдается в том случае, когда кислота служит донором протона, присоединяющегося к атoму кислорода в кольце молекулы сахара:

Как и в предыдущем случае, возможен либо специфический кислотный катализ (под действием иона Н₃O⁺), либо общий кислотный катализ.

Можно полагать, что при функционировании ферментов реализуются общий основный и общий кислотный катализ. Ферменты не способны локально концентрировать протоны или гидроксильные ионы с тем, чтобы обеспечить специфический основный или специфический кислотный катализ. Однако определенные ионогенные группы ферментов при их нормальной степени протонирования, соответствующей pH клетки, могут выступать в роли общекислотных и общеосновных катализаторов.

г. Согласованные механизмы

Третий возможный тип катализа предполагает синхронное действие основания и кислоты, обусловливающее одновременный разрыв старой связи и образование новой. Известно, например, что мутаротация тетраметилглюкозы в бензоле, содержащем либо пиридин (основание), либо фенол (кислоту), протекает очень медленно. Однако, когда в растворе одновременно присутствуют и пиридин, и бензол, мутаротация протекает существенно быстрее. На основании этого факта Свейн и Браун [50] предложили согласованный механизм, в котором одновременно участвуют и кислота, и основание:

Заметим, что в ходе реакции кислота ВН⁺ превращается в сопряженное основание В, а основание В' — в сопряженную кислоту НВ'. Может показаться, что, поскольку эти агенты изменяются в ходе реакции, они не являются истинными катализаторами. Однако простой обмен протонов восстанавливает исходные формы и завершает каталитический цикл. В водных растворах вода сама может выступать в роли кислоты или основания или даже одновременно в роли кислоты и основания при согласованном катализе.

Экспериментальные данные о наличии согласованного кислотно-основного катализа процесса мутаротации тетраметилглюкозы в бензоле фенолом и пиридином считаются в настоящее время недостаточно убедительными [51, 52]. Для неферментативных реакций, протекающих в водных растворах, доказать существование такого механизма катализа весьма трудно¹⁾. Однако он может играть исключительно большую роль в случае ферментативного катализа, поскольку среди боковых групп аминокислот могут найтись две соответствующим образом расположенные кислотные и основные группы.

д. Соотношения Брёнстеда

Эффективность данного основания как общего основного катализатора можно обычно связать с его основностью (рК_а), воспользовавшись уравнением Брёнстеда [53]:

lgk_B = lgG_B + ß(pK_a).       (6-80

Константа k_B в этом уравнении определяется выражением (6-77), а G_B представляет собой постоянную величину для реакции данного типа. Аналогичное соотношение связывает константу скорости k_A для общего кислотного катализа с величиной рK_а:

lg k_HB = lg G_A — а (рК_а).       (6-81)

Эти уравнения подобны линейным соотношениям, в которые входит свободная энергия (гл. 3, разд. Д), однако они касаются скоростей, а не равновесий. Правда, уравнение Гаммета [уравнение (3-66)] также очень часто применяется не только к константам равновесия, но и к константам скорости.

Условием выполнимости уравнений Брёнстеда является существование прямой связи между свободной энергией активации реакции и основностью (или кислотностью) катализатора.

Коэффициенты β и а в уравнениях (6-80) и (6-81) характеризуют чувствительность скорости реакции к изменению основности или кислотности катализатора. Нетрудно показать, что в том случае, когда ß или а близки к 1, общий основный или общий кислотный катализ обычно отсутствуют и скорость реакции определяется только специфическим катализом гидроксильным или водородным ионом [53]. При уменьшении ß или а до 0 вклад основного или кислотного катализа тоже становится исчезающе малым. Таким образом, общий основный или общий кислотный катализ наиболее существен при значениях коэффициентов ß и а, близких к 0,5. При этих условиях, как нетрудно видеть, такое относительно слабое основание, как имидазол (в боковой цепи гистидина), может оказаться необычайно эффективным катализатором при pH 7.

¹⁾ Недавно, правда, было показано, что катализ енолизации ацетона уксусной кислотой и ацетатом действительно протекает по согласованному кислотно-основному пути [52а].

Для экспериментального определения значений ß и а необходимо построить график зависимости lgk_Bили lgk_HBот рK_а (график Брёнстеда) и определить наклон полученной прямой. В случае ионизированных аминогрупп, в которых от атома азота может отщепиться один из трех протонов, и дикарбоновых кислот нужно вводить статистические поправки (гл. 4, разд. В, 5).

Любой механизм, для которого выполняется общий основный или общий кислотный катализ, характеризуется одним важным свойством: отщепление или присоединение протона происходит на стадии, лимитирующей скорость реакции.

е. Таутомерный катализ

Свейн и Браун [50] провели весьма интересный эксперимент, показавший, что кислотная и основная группы, включенные в одну и ту же молекулу, катализируют мутаротацию сахаров гораздо эффективнее, чем простая смесь кислоты и основания. Так, 0,001 М а-оксипиридин катализирует мутаротацию тетраметилглюкозы (0,1 М) в бензоле в 7000 раз более эффективно, чем смесь, содержащая 0,001 М пиридин и 0,001 М фенол. Свейн и Браун предложили следующий полностью согласованный механизм реакции для полифункционального катализатора а-оксипиридина. Они допустили, что реакции предшествует образование стабилизированного водородными связями комплекса, аналогичного фермент-субстратному комплексу:

продуктом превращения катализатора является 2-пиридон — таутомерная форма 2-оксипиридина, причем между обеими формами быстро устанавливается равновесие.

Рони [51] предложил называть катализ а-оксипиридином таутомерным катализом; он считает, что высокая эффективность этого катализатора обусловлена не просто близостью кислотной и основной групп в одной и той же молекуле, но и способностью катализатора совершать обратимые переходы из одной таутомерной формы в другую.

Предельное значение для констант скорости второго порядка в условиях, когда скорость реакции лимитируется диффузией, составляет приблизительно 10¹⁰ М^-1∙с^-1 (разд. А, 7). В 1956 г. Эйген [54], разработавший новые методы изучения быстрых реакций, сделал удивительное открытие, обнаружив, что протоны и гидроксильные ионы взаимодействуют гораздо быстрее, находять в решетке льда, чем в растворе: константы скорости второго порядка составляли 10¹³—10¹⁴ М^-1∙с^-1. Соответствующие им скорости реакции так же высоки, как скорости молекулярных колебаний; например, частота колебаний ОН-связи в воде²) составляет примерно 10¹⁴ с^-1. Объясняется этот факт, по-видимому, следующим. ОН^--ион и протон, который присоединяется к молекуле воды с образованием иона Н₃O⁺, связаны водородными связями с соседними молекулами воды. Поскольку во льду водородными связями соединены все молекулы воды, гидроксильные и водородные ионы оказываются соединенными цепочкой из молекул воды:

ж. Скорости переноса протона1)

Благодаря синхронному перемещению электронов от ОН^--иона через цепочку (маленькие стрелки на схеме) во время одного колебания может произойти нейтрализация зарядов. Заметим, что положения атомов кислорода к концу процесса остаются прежними, в то время как протоны, вовлеченные в образование водородных связей, слегка перемещаются на схеме влево. Реакция подобного типа не только является свидетельством удивительной подвижности водородных ионов, но и может иметь прямое отношение к таутомерному катализу в ферментах. Так, Уонг [55] высказал предположение, что перенос протона вдоль жестко фиксированной цепочки водородных связей в комплексе ES является неотъемлемой частью ферментативного катализа. Легко представить, что аналогичный синхронный сдвиг протонов может иметь место в связанных друг с другом карбоновой кислоте, имидазольной и фосфатной группах:

¹⁾ Динамике переноса протона в растворе с обсуждением биохимических модельных систем посвящен содержательный обзор Schuster Р., Wolschann Р, Tortschanoff К. в сборнике Molecular Biology, Biochemistry and Biophysics, v. 24, Chemical relaxation in molecular biology, Pecht I. and Rigler R. (Eds), Berlin, Springer-Verlag, 1977, pp. 107—109. — Прим. пepeв.

²⁾ Частота колебаний ОН-связи равна частоте инфракрасного света, возбуждающего эти колебания. Частота v равна произведению волнового числа (для —ОН-связи оно составляет 3710 см^-1) на скорость света с (3∙10¹⁰см∙с^-1). Следовательно, частота колебаний —ОН-связи в молекуле воды v = 3∙10¹⁰∙37¹⁰ = 1,14∙10¹⁴ с^-1.

В результате происходит перенос протона от одного конца цепи к другому [как и на схеме (6-83)], что обеспечивается легким протеканием реакций таутомеризации. Аналогичный процесс может идти и при участии боковых групп белка, объединяя две группы активного центра и способствуя таким образом согласованному кислотно-основному катализу, подобно тому, как это происходит на схеме (6-79).

В белках возможны и другие процессы таутомеризации (при наличии менее стабильных «минорных таутомеров»). Так, например, может иметь место сдвиг следующего типа с участием пептидных связей в а-спирали или ß-структуре:

Как показано на схеме, электроны перемещаются к гуанидиновой группе боковой цепи аргинина. Можно рассмотреть и другие варианты (и таких вариантов множество, особенно если учесть, что в реакции могут принимать также участие коферменты или пуриновые и пиримидиновые основания). Все подобные процессы протекают исключительно быстро и с трудом регистрируются.

з. Влияние pH на активность ферментов

Изложенные выше данные об участии кислотных и основных групп: в ферментативном катализе получены в основном в результате исследований неферментативных модельных реакций. Имеются ли какие-либо указания на то, что ферменты действительно содержат подобные группы? Да, имеются, и наиболее четкое из них — зависимость ферментативной активности от pH. Довольно часто кривая зависимости V_mах от pH имеет колоколообразную форму (рис. 6-13). Оптимальное значение V_mах наблюдается при значении pH, часто лежащем в интервале от 6 до 9. Кривые колоколообразной формы проще всего объяснить, допустив, что в активном центре фермента имеются две ионогенные группы — а и b. В этом случае фермент может находиться в трех формах, различающихся по степени протонирования, — Е, ЕН, ЕН₂:

Обозначим константы диссоциации ДЛЯ двух групп в ферменте через К_аЕ и К_bE, а соответствующие значения для комплекса ES — через K_aESи K_bES. Константы скорости k₁, k₂и k₃характеризуют стадии образования и распада комплекса ES.

Если допустить, что единственной реакционноспособной формой фермента, распадающейся с образованием продуктов, является форма EHS, то зависимости максимальной скорости от pH будут иметь колоколообразную форму (рис. 6-13). Подобные кривые часто встречаются в ферментативной кинетике, что подтверждает адекватность схемы (6-86). Кроме того, если для протекания реакции группа а фермента должна быть диссоциирована до сопряженного основания, а группа b должна находиться в протонированном состоянии, то естественно допустить, что эти две группы участвуют в кислотно-основном катализе.

РИС. 6-13 Теоретические зависимости V_mах от pH, рассчитанные исходя из уравнения (6-87) при k₃[E]_t = 1, pK_aES = 6 и следующих значениях pK_bES: I — 7, II — 8 и III —10 [58] Построенные при помощи ЭВМ графики любезно предоставлены К. Харрисом (С. Harris).

Для простого случая, описываемого схемой (6-86), рН-зависимости максимальной скорости и константы Михаэлиса описываются соответственно следующими выражениями:

Когда фермент полностью насыщен субстратом, присутствуют только формы EH₂S, EHS и ES. Из определения K_aESи К_bES следует, что при этом выполняется соотношение

В скобках стоит та же величина, что и в знаменателе выражений (6-87) и (6-88); иногда ее называют рН-функцией Михаэлиса [56]. Аналогичная по виду pH-функция для свободного фермента стоит в числителе выражения (6-88). pH-зависимость ферментативной активности часто имеет более сложный вид, чем зависимости, представленные на рис. 6-13 и описываемые приведенными выше уравнениям. Однако не составляет труда записать pH-функции Михаэлиса, а также соответствующие уравнения, подобные уравнениям (6-86) - (6-89), и для фермента с любым числом ионогенных групп в формах Е и ES. Следу иметь в виду, что в том случае, когда свободный субстрат содержит группы, диссоциирующие в том интервале pH, в котором изучается ферментативная активность, в числителе выражения (6-88) появится и рH-функция для свободного субстрата. Если в изменение активности ф^ермента при варьировании pH вносит вклад изменение конформации белковой молекулы, то возможно кооперативное присоединение или отдача более чем одного протона, что должно отразиться на рН-функции Михаэлиса. Иногда это может привести к появлению дополнительного члена, аналогичного (4-32). Характер pH-зависимости ферментативной активности был детально проанализирован Диксоном [56], который предложил строить графики зависимости lg V_mах (или логарифма удельной активности) и — lg К_M от pH.

РИС. 6-14. А Зависимость V_mах от pH для кристаллической бактериальной а-амилазы [56а]. Б. Теоретическая зависимость lg К_M от pH, рассчитанная исходя из уравнения (6-88) при рK_аЕ = 5, рK_bЕ = 10, pK_aES = 6 и pK_bES = 7. Построенный при помощи ЭВМ график любезно предоставлен К. Харрисом.

Типичные кривые такого рода представлены на рис. 6-14. В области значений рН = рK_а± ~ 1,5 график зависимости lg V_mах от pH имеет криволинейную форму, однако за пределами этого интервала ветви кривой асимптотически приближаются к прямым, наклон которых равен единице, если в процессе диссоциации участвует один протон, или больше единицы, если имеет место кооперативная диссоциация нескольких протонов. Точки пересечения асимптот с отрезком прямой, параллельной оси абсцисс (ом. рис. 6-14), соответствуют значениям рKа. (Следует, однако, отметить, что к более надежным результатам приводит описание всех экспериментальных точек единой теоретической кривой.) Криволинейный участок проходит всегда ниже (или выше) точек пересечения на величину, равную lg 2 = 0,30 (или меньшую, если диссоциация протонов происходит кооперативно).

Вогнутые участки кривых зависимости lg K_M от pH дают значения рKа свободного фермента или свободного субстрата, а выпуклые — значения рKа комплекса ES. Подобный подход к анализу рН-зависимостей параметров ферментативной реакции широко применяется энзимологами, однако он часто приводит к некорректным результатам. Например, многие кривые такого рода имеют очень резкий перегиб, криволинейный участок у них занимает интервал рН<3; при этом расстояние по ординате между кривой и точкой пересечения асимптоты с горизонтальным участком гораздо меньше 0,301). Это означает, что связывание протонов происходит кооперативно и кажущийся рKа сходен в таком случае с константой K в уравнении (4-33). Читателю, желающему глубже разобраться в обсуждаемых вопросах, можно рекомендовать теоретическую работу [57], где рассматриваются значения рK_а переходного состояния. Интересный анализ кривых с необычно острым максимумом проведен в работах [57а,b].

Примером фермента, детально изученного с точки зрения влияния pH на кинетические параметры, может служить фумараза — фермент, катализирующий обратимую гидратацию фумаровой кислоты до яблочной [схема (6-64)]. В своей ранней очень интересной работе Алберти и др. [58] показали, что колоколообразная pH-зависимость имеет место как для прямой, так и для обратной реакции. Используя уравнения (6-88) и (6-89), эти исследователи рассчитали кажущиеся значения рK_а для групп а и b фермента в буферных растворах с ионной силой 0,01 (табл. 6-1). Важно отдавать себе отчет в том, что кинетика этой обратимой реакции описывается более сложными уравнениями, чем уравнения (6-87)—(6-89), и поэтому кажущиеся значения рK_а могут не совпадать с истинными. Однако очень заманчиво было бы допустить, что два значения рK_а для свободного фермента, равные 6,2 и 6,8, соответствуют идентичным группам, по-видимому, имидазольным, со значениями микроскопических рK_а, составляющими — 6,5. Свойства фумаразы будут обсуждаться далее в гл. 7, разд. 3,6.

Мутаротация глюкозы у Е. coli катализируется специфической мутаротазой [59], имеющей число оборотов 10⁴ с^-1. Форма графика зависимости — lg K_M от pH указывает на наличие в свободном ферменте двух ионогенных групп со значениями рК_a 5,5 и 7,6, а из характера зависимости lg V_mах от pH следует, что в комплексе ES присутствует одна группа с рК_а = 4,75 [59]. Последняя может представлять собой каталитическую группу [группу В' в схеме (6-79)], возможно имидазол в форме сопряженного основания. Почему группа, имеющая в свободном ферменте рK_а = 7,6, никак не проявляется в комплексе ES? Либо эта группа не участвует в катализе, либо величина рК_а для нее так сильно сдвигается при связывании субстрата, что группу не удается выявить с помощью кривой зависимости lg V_max от pH. Таким образом, экспериментальные данные не позволяют окончательно решить вопрос о том, участвует ли в работе мутаротазы ионогенная группа, соответствующая на схеме (6-79) группе —ВН⁺.

¹⁾ Удивительно, что для большей части кривых, приводимых Диксоном и Уэббом [56] для иллюстрации pH-профилей ферментативной активности, наблюдается такое же отклонение от теоретической зависимости Многие из полученных значений рKа могут быть некорректными из-за участия в процессе диссоциации нескольких протонов, что приводит к более резким pH-переходам, или в результате экспериментальных ошибок (например, ошибок, связанных с влиянием буфера).

Таблица 6-1 Кажущиеся значения рК_a для фумаразы и ее комплексов с фумаратом и малатом [58]