Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 3 - Д. Мецлер 1980

Биохимическая генетика и синтез нуклеиновых кислот и белков
Транскрипция молекул РНК
Транспортная РНК (тРНК)

Наиболее хорошо изученной формой РНК являются небольшие 4S-молекулы тРНК с мол. весом приблизительно 26000, состоящие из 75±5 нуклеотидов (рис. 2-24 и 15-8). Похоже, что по размерам и основным структурным характеристикам тРНК бактериальных и эукариотических клеток не различаются. Наличие «адаптеров», необходимых для переноса аминокислот в соответствующие участки матричной цепи мРНК, было предсказано еще до открытия тРНК. Предполагалось, что в молекуле «адаптора» должна иметься нуклеотидная последовательность, образующая антикодон, который должен точно располагаться против соответствующего кодона, в каком-то связывающем участке белоксинтезирующей системы. Как теперь известно, молекулы тРНК действительно обладают предсказанными свойствами, однако при изучении их химических свойств было обнаружено много неожиданного. Во-первых, молекулы тРНК оказались длиннее, чем это необходимо для формирования адаптеров, а во-вторых, многие основания, входящие в их состав, сильно модифицированы по сравнению с исходными соединениями [60].

Еще одна удивительная особенность, характерная для строения молекул тРНК, состоит в том, что в состав антикодонов входят не только «стандартные» основания. Так, например, в состав некоторых антикодонов входит гипоксантин (нуклеозидом которого является инозин).

На рис. 15-8, A приведено общепринятое изображение молекулы тРНК в виде «клеверного листа». Трехмерная структура тРНК, определенная независимо двумя группами исследователей [61, 62], схематически показана на рис. 15-8, Б.

Рассмотрим четыре «стебля», образованных нуклеотидными парами, связанными при помощи водородных мостиков (рис. 15-8). Один из этих «стеблей» заканчивается акцепторным концом, т. е. участком, в котором происходит связывание аминокислоты. Акцепторный конец присоединяет и переносит активированную аминокислоту, генерируемую в соответствии с уравнением (11-2). Три остальных «стебля» заканчиваются петлями, в состав которых обычно входит значительное число модифицированных оснований. Дигидроуридииовая петля, например, содержит 5,6-дигидроуридин в различном количестве и в различных положениях. В антикодоновой петле всегда находится антикодон, расположенный в клеверном листе на конце, прямо противоположном акцепторному концу. На стороне 5'-конца антикодона всегда находится U (на рисунке обведен кружком), за которым следует еще один пиримидиновый нуклеотид. Со стороны 3'-конца антикодона обычно находится так называемый «супермодифицированный» нуклеотид. ТφС-петля содержит специфическую нуклеотидную последовательность, от которой и происходит ее название. У бактерий последовательность ТφС была обнаружена во всех изученных бактериальных тРНК, участвующих в синтезе белка; в молекулах же инициаторной тРНК эукариотических клеток вместо этой последовательности может находиться последовательность UCG [63—65].

РИС. 15-8. Наверху. Схематическое изображение молекулы фенилаланиновой тРНК из дрожжей: структура клеверного листа. Точками обозначены водородные связи (две или три). Нуклеотиды, встречающиеся в молекулах почти всех тРНК, обведены кружком. Отмечены также и другие особенности, свойственные молекулам почти всех тРНК. В нижней части рисунка показано, как антикодон может взаимодействовать с кодоном мРНК Внизу. Трехмерная структура фенилаланиновой тРНК из дрожжей [61].

Гены, кодирующие синтез молекул тРНК, как у бактерий, так и у млекопитающих, объединены в кластеры, т. е. в определенные группы, при транскрипции которых образуются крупные молекулы — предшественники РНК, содержащие иногда молекулы более чем одного вида тРНК [66—69]. Для формирования зрелых молекул тРНК путем «разрезания и обстригання» («cutting and trimming») их предшественников необходимы по меньшей мере три различные нуклеазы [57, 66, 69].

Так, в случае тирозиновой тРНК¹⁾ Е. coli в молекуле непосредственного предшественника (рис. 15-9) содержится 129 нуклеотидов — на 44 больше, чем в молекуле зрелой тРНК. Из этих избыточных нуклеотидов 41 расположены с 5'-конца и три — с 3'-конца. Специальная нуклеаза (РНКаза Р) разрывает лишь одну связь в молекуле-предшественнике, отщепляя с 5'-конца фрагмент, состоящий из 41 нуклеотида. В результате действия другой нуклеазы (РНКаза PI1I) с противоположного конца отщепляется фрагмент, состоящий из трех нуклеотидов [66]. Дальнейшее разрушение отщепившихся фрагментов происходит под воздействием дополнительных ферментов [70].

Важным достижением химии явился синтез двухцепочечного фрагмента ДНК, кодирующего тирозиновую тРНК [71] Е. coli и ее предшественник [71а], осуществленный Кораной и его сотрудниками. Эти исследователи продолжили свою работу, чтобы охватить участок, терминирующий считывание гена, расположенный вне участка, кодирующего синтез CCA-конца тРНК. Была определена последовательность 23 нуклеотидов цепи ДНК, расположенных за участком, кодирующим синтез CCA-конца тРНК [72, 73] (рис. 15-9). Здесь следует отметить две особенности. Первая из них состоит в наличии участка, обладающего вращательной симметрией второго порядка (на рис. 15-9 он обозначен вертикальными линиями и точкой в центре), который может служить сигналом терминации. Вторая особенность связана с наличием двух участков, в которых короткие последовательности нуклеотидов повторяются, но в обратном направлении, например TGAAGT. Играют ли эти участки роль генетических сигналов, пока неизвестно²⁾.

Участок из 29 нуклеотидов, расположенных перед геном тирозиновой тРНК, содержит оператор, последовательность которого также не установлена [75].

Процесс формирования окончательных молекул тРНК помимо «обстригання» предшественника нуклеазами сопровождается также значительными модификациями пуриновых и пиримидиновых оснований [64]. Известно шестьдесят или даже больше реакций, приводящих к таким модификациям; число и степень таких модификаций неодинаковы для разных видов. Строение некоторых модифицированных оснований показано на рис. 15-10. На примере уридина, приведенного на рис. 15-10, можно видеть, что возможны различные типы модификаций. Одной из наиболее типичных модификаций является метилирование, которое может происходить как по основанию, так и по 2'-гидроксильной группе сахарного остатка. Метилирование уридина по положению 5' приводит к образованию риботимидина. По этому же положению может быть модифицирован и цитидин. При восстановлении двойной связи между С-5 и С-6 образуется дигидроуридин. Замещение кислорода в положении 4 на серу дает 4-тиоуридин. На рис. 15-10 показано место возможного метилирования гуанозина. Для обозначения метилирования оснований нуклеиновых кислот часто используют символ m (диметилирование обозначают m²⁾.

¹⁾ Минорная тирознновая тРНК, кодируемая супрессорным геном supF (разд. Г,6).

²⁾ Для обозначения участков двухцепочечной ДНК, обладающих симметрией второго порядка, часто используют слово «палиндром» (гл. 2, разд. Г, 11). К сожалению, Корнберг [73] и другие исследователи воспользовались этим термином также и для обозначения примыкающих друг к другу участков одноцепочечной ДНК с обращенной последовательностью. Хотя такой палиндром должен как будто считываться одинаково в обоих направлениях, тем не менее ни одна ферментная система, движущаяся вдоль двухцeпочечной (или даже одноцепочечной) ДНК, не сможет, его прочитать oдинаково.

РИС. 15-9. Предполагаемая вторичная структура предшественника тирозиновой тРНК Е. coli. Нуклеотиды, которые обнаруживаются в зрелой тРНК в модифицированной форме, представлены на рисунке с соответствующими модификациями (Schaeffer К. Р-. Altman S., Sоll D., PNAS, 70, 3626—3630, 1973). Показана также часть нуклеотидной последовательности участка гена, кодирующего тРНК и расположенного после CCA-конца. Обратите внимание на участок, обладающий вращательной симметрией второго порядка (обозначен вертикальными линиями и точкой) и на два участка с обращенными нуклеотидными последовательностями.

РИС. 15-10. Строение некоторых обнаруженных в молекулах тРНК нуклеозидов, содержащих модифицированные основания. Положения, в которых может осуществляться метилирование, обозначены буквой m.

Большой интерес представляет собой превращение уридина в псевдоуридин (ψ). Известно, что псевдоуридин образуется в результате перегруппировки уридина, осуществляемой в первоначальном гранскрипте, однако химия такого превращения еще неясна. Существенным является то, что псевдоуридин, так же как и урацил, может «спариваться» с аденином. Основание, обозначаемое буквой Y, представляет собой сильно модифицированный гуанин. На рис. 15-10 показаны два «сверхмодифицированных» аденозина. На 3'-концах антикодонов, «спаривающихся» с кодонами, начинающимися с U, обнаруживается N⁶-изопептеннладенозин. Интересно, что у растений именно это соединение служит гормоном, известным под названием цитокинина (гл. 16, разд. А, 3).

Другой сильно модифицированный пурин — треонилкарбамонладенин — обычно примыкает к тому концу антикодонов, которые взаимодействуют с кодонами, начинающимися с А. Функция этих сильно модифицированных оснований неясна, однако похоже, что они нужны для правильного связывания тРНК с рибосомами. Специфический фермент, осуществляющий перенос изопентенильной группы с изопентилпирофосфата, был выделен в чистом виде (гл. 12, разд. 3) [76].

Интересная особенность метаболизма тРНК, которую мы до сих пор не рассматривали, связана с 3'-концевой группой, состоящей из трех нуклеотидов: ССА. Эта легко отщепляемая и вновь синтезируемая группа неизменно присутствует в молекулах всех тРНК. Скорость «оборота» этой группы достаточно высока для того, чтобы включить «в работу» приблизительно 20% молекул тРНК в промежуток между двумя делениями клетки, однако она значительно ниже той скорости, с которой молекулы тРНК участвуют в синтезе белка. Таким образом, этот процесс, по-видимому, непосредственно не связан с образованием пептидной связи.