Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022
Методы экспериментального исследования структуры белков
Масс-спектрометрия электронного удара
Общие принципы масс-спектрометрического определения аминокислотной последовательности
Основное достоинство метода масс-спектрометрии при установлении аминокислотной последовательности пептидов и белков состоит в том, что он позволяет анализировать смеси этих веществ. Классический дансил-эдмановский метод требует обязательного предварительного выделения отдельных фрагментов после расщепления белковой цепи. Эта стадия является трудоемкой и лимитирует весь процесс секвенирования по Эдману. В методе масс-спектрометрии нет необходимости выделять отдельные фрагменты, достаточно грубого разделения всей смеси на отдельные фракции.
Благодаря различной летучести модифицированных фрагментов белковой цепи, отдельные ее компоненты можно последовательно испарить при плавном нагревании. При таком подходе газовая фаза всегда оказывается обогащенной каким-либо одним фрагментом. Сравнивая масс-спектры, полученные при различных температурах, почти всегда удается однозначно установить аминокислотную последовательность отдельных фрагментов. Такой прием дает приемлемые результаты при анализе смесей содержащих до пяти различных пептидов.
Для повышения надежности заключений о порядке следования аминокислот в исходном белке метод масс-спектрометрии сочетают, как правило, с классическими методами, придерживаясь такой примерно стратегии.
> Определяют N-концевую аминокислоту в автоматическом секвенаторе или вручную.
> Пептиды, образующиеся после специфического ферментативного расщепления белка трипсином или химотрипсином, анализируют по методу Эдмана.
> Аминокислотную последовательность коротких пептидов, полученных неспецифическим расщеплением белка эластазой или субтилизином, определяют методом масс-спектрометрии в смесях. В сочетании с п.2 это позволяет установить места встраивания крупных пептидных фрагментов в белковую цепь.
Методология исключительно масс-спектрометрического исследования белка на его аминокислотную последовательность включает такие этапы.
> Белок расщепляют неспецифически эластазой или субтилизином на относительно мелкие фрагменты.
> Короткие пептиды отделяют от негидролизованного белка и крупных фрагментов методом гель-фильтрации.
> Смесь коротких пептидов разделяют колоночной хроматографией на катионитах (например ДАУЭКС) или методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. При использовании катионитов лучшим элюэнтом является смесь пиридина с уксусной кислотой, а ВЭЖХ - смесь уксусной кислоты с пропанолом.
> Отбирают в процессе хроматографироования фракции, содержащие до 5-ти пептидов, и высушиваются.
> В полученных фракциях проводят химическую модификацию пептидов и определяют последовательность аминокислот методом масс-спектрометрии.