Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022
Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы определения молекулярной массы белков
Определение молекулярной массы методом гель-фильтрации
В основе метода определения молекулярной массы белков с применением гель-фильтрации лежит следующий эмпирический факт. Установлено, что объемы элюирования различных белков с одинаковыми молекулярными массами на одной и той же колонке в идентичных условиях практически совпадают. Это позволяет определять молекулярную массу неизвестного белка, если колонка с гелем предварительно проградуирована (прокалибрована). Калибровка состоит в определении объемов элюирования нескольких чистых белков с известной молекулярной массой. Полученные данные наносят на график в виде зависимости логарифма ММ от объема элюирования (Ve). Такие зависимости в пределах одного - полутора порядков по величине молекулярных масс имеют, как правило, линейный вид. В качестве примера, на рисунке выше приведен такой график для ряда белков.
Вместо объема элюирования иногда пользуются коэффициентом распределения (Кр), который рассчитывают по формуле:
Kp = (Ve - Vвнеш) / Vвнутр
и строят далее калибровочный график в координатах линейного уравнения:
Kp = B - Alg MM
Отклонения от линейности наблюдается для очень больших молекул, низкомолекулярных веществ и некоторых белков. Таких, например, как коллаген и фибриноген.
Для глобулярных белков и многих углеводов описанный метод определения молекулярной массы дает надежные результаты (= 10%).
При фракционировании белков в тонком слое геля G-200 (на пластине) наблюдается линейная зависимость между относительной длиной пробега пятна с белком и логарифмом его молекулярной массы. Относительную длину пробега рассчитывают по отношению к длине пробега некоторого стандартного белка, например, гемоглобина.
Для получения достоверных результатов гель-фильтрацию рекомендуется проводить в присутствии денатурирующих агентов, в концентрированном растворе хлоргидрата гуанидина, например.