БИОХИМИЯ - Л. Страйер - 1984

ТОМ 3

Часть IV ИНФОРМАЦИЯ

ГЛАВА 26. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД Т ЗАВИСИМОСТЬ МЕЖДУ ГЕНАМИ И БЕЛКАМИ

26.13. Мутации возникают в результате изменений последовательности оснований ДНК

Существуют мутации нескольких типов: 1) замена одной пары оснований (или нескольких пар) другой парой; 2) делеция одной или более пар оснований; 3) вставка (включение, инсерция) одной или более пар оснований (рис. 26.11). Наиболее распространенный тип мутаций - замена одной пары оснований другой парой. Частота спонтанных мутаций у бактериофага Т4 была оценена в 1,7 • 10^-8 на одну пару оснований за один цикл репликации. Для E. coli и Drosophila melanogaster эти величины составляют 4 • 10^-10 и 7 • 10^-1соответственно.

Рис. 26.11. На примере типографских ошибок можно проиллюстрировать различные типы мутаций

Существует два типа одиночных замен пары оснований. Транзиция - замещение одного пурина другим пурином или одного пиримидина другим пиримидином. Трансверсией, наоборот, называется замещение пурина пиримидином или пиримидина пурином:

Механизм спонтанного возникновения транзиций был предложен Уотсоном и Криком в их классической работе о двойной спирали ДНК. Они отметили, что некоторые атомы водорода каждого из четырех оснований могут менять свое положение. Такие таутомерные формы, которые возникают с низкой вероятностью, могут обра-

завывать необычные пары оснований, отличные от А-Т и G-C. Например, таутомерная иминоформа аденина может спариваться с цитозином (рис. 26.12). В следующем цикле репликации этот аденин, возможно, снова перейдет в свое обычное таутомерное состояние и будет спариваться с тимином, тогда как цитозин будет спариваться с гуанином. В результате одна из дочерних молекул ДНК будет содержать пару G-C вместо пары А-Т (рис. 26.13).

Рис. 26.12. Редкая таутомерная форма аденина спаривается с цитозином вместо тимина. Этот таутомер образуется при сдвиге протона 6-аминогруппы к атому N-1

Рис. 26.13. Спаривание редкой таутомерной формы аденина (А*) с цитозином (С) привоцит к появлению пары G—С в следующем поколении

Кроме того, мутации могут вызывать дефектные ДНК-полимеразы. Существует мутант E. coli, у которого частота мутаций в 1000 раз выше, чем в норме, возможно, из- за измененной полимеразы. Отличительная особенность мутаций этих клеток состоит в том, что почти все они являются трансверсиями А-Т → G-C.

26.14. Некоторые химические мутагены весьма специфичны

В ДНК можно включить аналоги оснований, например, 5-бромурацил и 2-аминопурин. Они вызывают транзиции, нарушая правила спаривания оснований в процессе их собственного включения в состав ДНК или в следующем цикле репликации (рис. 26.14). Аналог тимина 5-бромурацил в норме спаривается с аденином. Однако доля енольного таутомера в 5-бромурациле выше, чем в тимине, возможно, из-за высокой электроотрицательности атома брома по сравнению с метильной группой при С-5. Енольная форма 5-бромурацила спаривается с гуанином, и это вызывает транзиции А-Т → G-С 2-аминопурин в норме спаривается с тимином. В отличие от аденина обычный таутомер 2-аминопурина может образовать одну водородную связь с цитозином. Поэтому 2-аминопурин способен вызывать транзиции А-Т → G-C.

Рис. 26.14. Аналог тимина 5-бромурацил иногда спаривается с гуанином вместо аденина. Присутствие атома брома при С-5 увеличивает долю редкого таутомера, образующегося при сдвиге протона от N-3 к атому кислорода при С-4

В основе действия других мутагенов лежат химические модификации оснований ДНК. Например, азотистая кислота реагирует с основаниями, имеющими аминогруппу. При этом происходит окислительное дезаминирование аденина до гипоксантина, цитозина до урацила, гуанина до ксантина. Образующийся при этом гипоксантин спаривается с цитозином, а не с тимином, ура- цил спаривается с аденином, а не с гуанином. Ксантин, как и гуанин, спаривается с цитозином. Поэтому азотистая кислота вызывает транзиции А-Т → G-C. Гидроксиламин (NН₂ОН) - высокоспецифичный мутаген. Он реагирует почти исключительно с цитозином и дает производное, которое спаривается с аденином, а не с гуанином. Гидроксиламин вызывает транзицию только в одном направлении: G-С → А-Т.

Другой тип мутаций вызывают плоские ароматические молекулы, например, акридины. Эти соединения интеркалируют в ДНК, т.е. проскальзывают между соседними парами оснований в двойной спирали ДНК (разд. 25.18). Интеркаляторы, видимо, стабилизируют спаривание оснований со сдвигом в повторяющихся последовательностях, таких, например, как CGCGCGCG. В результате они вызывают включения или делеции одной, или более пар оснований. Действие таких мутаций заключается в изменении рамки считывания, если только общее число делетированных или включившихся оснований не кратно трем. Именно анализ таких мутантов позволил доказать триплетность генетического кода.

26.15. Многие мутагенные канцерогены можно выявить по их мутагенному действию на бактерии

Многие опухоли у человека возникают в результате воздействия токсичных химических веществ. Поскольку эти химические канцерогены обычно мутагенны, можно думать, что повреждение ДНК лежит в основе и канцерогенеза, и мутагенеза. Эти соединения важно идентифицировать и оценить их потенциальную биологическую активность, чтобы свести к минимуму то воздействие, которое они оказывают на человека. Брюс Эймс (Bruce Ames) разработал простой и чувствительный тест для выявления химических мутагенов. На чашку Петри помещают тонкий слой агара, содержащий около 10⁹ клеток специально сконструированного тест-штамма Salmonella. Эти бактерии не способны расти в отсутствие гистидина, поскольку они несут мутацию в одном из генов биосинтеза этой аминокислоты. Добавление мутагена в центр чашки индуцирует появление множества новых мутаций. Небольшая часть этих мутаций приводит к реверсии исходной мутации (возврат к дикому типу), так что клетки приобретают способность синтезировать гистидин. Эти ревертанты размножаются в отсутствие экзогенного гистидина и появляются в виде отдельных колоний на чашке после инкубации чашки в течение двух дней при 37°С (рис. 26.15). Например, 0,5 мкг 2-аминоантрацена дают 11.000 колоний ревертантов по сравнению всего лишь с 30 спонтанными ревертантами в отсутствие этого мутагена. Можно легко поставить опыт с различными концентрациями исследуемого соединения, чтобы получить кривую доза-ответ. Обычно эта зависимость имеет линейный характер; отсюда следует, что пороговой концентрации в процессах мутагенеза нет.

Рис. 26.15. Тест на мутагены с использованием сальмонеллы. А. На чашку Петри посеяно примерно 10⁹ бактерий, неспособных синтезировать гистидин. Б. На чашку помещен кружок фильтровальной бумаги, пропитанный мутагеном. В результате возникает множество ревертантов, способных синтезировать гистидин. Эти ревертанты видны в виде ореола колоний вокруг белого кружочка. Небольшое число колоний на чашке А - спонтанные ревертанты

Некоторые тест-линии чувствительны к заменам пар оснований, тогда как другие можно использовать для выявления делеций или вставок пар оснований (сдвигов рамки). Чувствительность этих штаммов, сконструированных специально для оценки мутагенов, увеличена генетически: они лишены системы эксцизионной репарации. Кроме того, у них нет липополисахаридной оболочки, которая обычно окружает клетки Salmonella. Отсутствие этого барьера облегчает проникновение в клетку потенциальных мутагенов. Еще одна важная особенность этой системы выявления мутагенов - добавление гомогената печени млекопитающих. Напомним, что некоторые потенциальные канцерогены превращаются в активную форму под действием ферментативных систем печени или других тканей млекопитающих (разд. 20.21). В бактериях эти ферменты отсутствуют, в связи с чем на чашку наносят несколько миллиграммов гомогената печени, чтобы активировать подобные мутагены. Например, соединение с реакционноспособной боковой цепью (дающее ему возможность образовать ковалентную связь с ДНК) и с ароматической группой (которое позволяет ему интеркалировать) обладает значительно большей мутагенностью, чем такое же соединение, состоящее из одной ароматической группы.

В настоящее время тест с использованием Salmonella широко используется для оценки опасности мутагенного и канцерогенного действия множества разнообразных химических соединений. Эта быстрая и недорогая бактериологическая проба на мутагенность дополняет эпидемиологические обследования и пробы на животных, которые всегда оказываются более трудоемкими, медленными и дорогими. Тест на мутагенность с использованием Salmonella - ответвление исследований взаимосвязи гена и белка у бактерий. Это - удивительный пример того, как фундаментальные исследования в области молекулярной биологии могут непосредственно внести важный вклад в здравоохранение.