БІОХІМІЯ - Підручник - Остапченко Л. І. - 2012

Розділ 10. МЕТАБОЛІЗМ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

10.1. Нуклеази

Нуклеїнові кислоти гідролізуються в тканинах організму за допомогою нуклеаз. Нуклеази - численні ферменти класу гідро- лаз, які різняться за механізмом дії, специфічністю та здійснюють різні важливі функції на багатьох стадіях біохімічних перетворень ДНК і РНК. Нуклеази беруть участь у різних процесах, пов'язаних з реплікацією, транскрипцією ДНК, у дозріванні РНК-транскриптів, у процесах, пов'язаних з трансляцією, рекомбінацією, репарацією нуклеїнових кислот, а також у захисті клітин від чужорідних нуклеїнових кислот.

За специфічністю розрізняють нуклеази, які: а) діють на ДНК (дезоксирибонуклеази) чи на РНК (рибонуклеази), або на обидві кислоти; б) руйнують одно- і/або дволанцюгові нуклеїнові кислоти; в) упізнають 3'- або 5'-кінці; г) розрізняють пуринові або піримідинові основи; д) упізнають певні нуклеотидні послідовності.

Суттєва різниця існує між ендонуклеазами, дія яких спрямована на внутрішньоланцюгові діефірні зв'язки лінійних і кільцевих молекул ДНК з утворенням фрагментів різної довжини, та екзонуклеазами, які діють тільки на кінцеві діефірні зв'язки - з 5'-, або з З'-кінця молекул ДНК і послідовно здійснюють гідроліз фосфодіефірних зв'язків і відщеплюють один за одним нуклео- зидмонофосфати.

Нуклеази різняться також за дією на фосфодіефірний зв'язок: одні нуклеази каталізують розрив між фосфатом і 3'-ОН групою з утворенням 5'-фосфомоноефірних кінців (рис. 10.1, А), інші - між фосфатом і 5'-ОН групою, внаслідок чого утворюються продукти з З'-фосфомоноефірними кінцями (рис. 10.1, Б).

Рис. 10.1. Два можливі способи гідролізу фосфодіефірних зв'язків нуклеїнової кислоти нуклеазами

Серед нуклеаз на особливу увагу заслуговують ендонуклеази рестрикції рестриктази, англ. restriction - обмеження). Ці ферменти впізнають у дволанцюгових молекулах ДНК не окремі нуклеотидні залишки, а нуклеотидні послідовності із 4-6 нуклеотидів і тому розщеплюють будь-яку ДНК на порівняно невелику кількість фрагментів. Крім того, існує велика кількість різних ендонуклеаз рестрикції, кожна з яких упізнає специфічну послідовність.

Назву рестриктази отримали у зв'язку з тим, що присутність їх у бактеріальній клітині обмежує ріст бактеріальних вірусів (бактеріофагів).

Рестриктази прийнято іменувати за назвою бактерій, з яких їх виділяють. Так, назва Bam Н1 свідчить, що цей фермент виділений із Bacillus amiloliquefaciens. Перша з трьох літер абревіатури відповідає першій літері назви роду (В); наступні дві літери є початковими літерами видової назви (am), літера Н означає штам, з якого виділений фермент, і нарешті, римська цифра відповідає порядковому номеру рестриктази в ряді аналогічних ферментів, виділених із цього мікроорганізму.

Рестриктази становлять частину захисної системи бактерій, яка обороняє власний геном від чужорідної (переважно вірусної) ДНК. Інша частина цієї системи представлена метилазами, які здійснюють специфічну модифікацію тієї ж послідовності, що й рестриктази. Метилази каталізують перенесення метильних груп від S-аденозилметіоніну до аденінового (з утворенням N-6 метиладеніну) або цитозинового (з утворенням 5-метилцитозина) залишків у межах сайту впізнавання рестриктазами. Метильований певним чином геном захищений від самодеградації рестриктуючими ендонуклеазами.

Розріз ДНК рестриктазами сайт-специфічних послідовностей може приводити до утворення "липких" (А) і "тупих" (Б) дволанцюгових кінцевих фрагментів ДНК (рис. 10.2). Ділянки ДНК, де відбувається розрізання тією чи іншою рестриктазою, називають сайтами рестрикції.

Рис. 10.2. Дія рестриктаз з утворенням "липких" (А) і "тупих" (Б) кінців фрагментів ДНК

Унаслідок високої специфічності до певних нуклеотидних послідовностей ендонуклеази рестрикції використовують для секвенування та молекулярного клонування. Секвенування геному (лат. sequentia - послідовність) - метод визначення сайтів рестрикції вздовж молекули ДНК; установлення взаємного розташування цих сайтів називають фізичним картуванням ДНК.

Молекулярне клонування генів (багаторазове копіювання) - метод, який дозволяє включати, виділяти та ампліфікувати (лат. amplificato - збільшення) окремі гени в реципієнтних, про- або еукаріотичних клітинах; клітини, які містять потрібний ген можна використовувати для отримання: а) великої кількості білка, який кодується даним геном, або б) великої кількості самого гена у високоочищеному вигляді.