БІОХІМІЯ - Підручник - Остапченко Л. І. - 2012

Розділ 10. МЕТАБОЛІЗМ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

10.6.Біосинтез ДНК (реплікація)

10.6.1. Ферменти реплікації

Незважаючи на простоту основного принципу, процес реплікації складно організований і вимагає участі багатьох білків і ферментів. Останні, як до речі, і всі інші білки, закодовані в послідовності нуклеотидів ДНК. У такий спосіб виникає петля зворотного зв'язку: ДНК спрямовує синтез білків, що реплікують ДНК.

Основними ферментами, які беруть участь у реплікації ДНК, є ДНК-залежні - ДНК-полімерази. Усі ДНК-полімерази прокаріотичних та еукаріотичних організмів володіють тією самою основною синтезуючою активністю - приєднують нуклеотиди до ОН-групи на З'-кінці одного з ланцюгів ДНК; отже, він зростає в напрямку 5'^3'.

Для здійснення ферментами 5'→3' полімеразної реакції необхідні наступні умови:

✵ матриця, на якій здійснюється синтез комплементарного полінуклеотидного ланцюга; у зоні реплікаційної вилки матрицею служить одноланцюгова ділянка ДНК;

✵ приманка, або праймер (англ. primer - первісний); ДНК- полімерази не здатні утворювати міжнуклеотидні зв'язки між двома вільними нуклеотидами, а тільки лише подовжувати уже наявний олігонуклеотид; у зв'язку з цим синтез ДНК починається після приєднання до ДНК-матриці невеликого олігорибонуклеотиду-приманки;

✵ субстрати; субстратами для синтезу ланцюга ДНК є чотири де- зоксирибонуклеотид-5'-трифосфати: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ.

У клітинах як прокаріотів, так і еукаріотів існує декілька різних ДНК-полімераз. Найкраще вивчені ДНК-полімерази E. coli. У клітинах цих бактерій виявлені три різні типи ДНК-полімераз - І, ІІ і ІІІ, які різняться передусім швидкістю каталізу та нуклеазною активністю.

ДНК-полімераза І має такі активності:

✵ полімеразна - приєднання комплементарних матричному ланцюгу дезоксирибонуклеотидів до вільної 3'-ОН-групи праймера в напрямку від 5'- до З'-кінця (5'—3') до молекули ДНК, що синтезується;

✵ екзонуклеазна - гідроліз фосфодіефірних зв'язків (відокремлення нуклеотидів) в одному ланцюзі ДНК або на неспареному кінці подвійної ДНК, починаючи з З'-кінця (3'—5') і 5'-кінця ланцюга (5'—З'). З'—5'-екзонуклеазна активність забезпечує контроль за приєднання кожного нуклеотиду та видалення помилкових нуклеотидів із зростаючого кінця ланцюга (коректорська правка), а 5'—З'-екзонуклеазна активність використовується для видалення рибонуклеотидів фрагментів Оказакі, що є необхідною передумовою для формування безперервності відстаючого ланцюга.

Здатність ДНК-полімерази І подовжувати З'-кінець одного з ланцюгів у місці розриву у дволанцюговій ДНК і видаляти нук- леотиди з 5'-кінця того ж розриву забезпечує репарацію (відновлення) пошкоджень у ДНК. Цей процес називається нік-трансляція (англ. nick-translation - усування прогалин).

ДНК-полімераза ІІ здійснює полімеразну активність повільніше, ніж ДНК-полімераза І, і для неї не властива 5'—3'-екзонуклеазна активність. Вважається, що цей фермент не є обов'язковим для реплікації ДНК, але здатний заповнювати прогалини

між фрагментами ДНК, спареними з матричним ланцюгом. Таким чином, наявність полімеразної та 3'→5'-екзонуклеазної активностей дає підстави стверджувати, що ДНК-полімераза ІІ бере участь у репарації ДНК.

ДНК-полімераза ІІІ- головний фермент, що відповідає за реплікацію ДНК E. coli. Фермент є основним компонентом мультиферментного комплексу, який ініціює формування реплікативних вилок у точках початку реплікації й бере участь в елонгації лідируючого ланцюга, а також подовжує РНК-приманки з утворенням фрагментів Оказакі. Окрім полімеразної активності, ДНК- полімеразі ІІІ притаманна 3'→5'-екзонуклеазна активність. Остання проявляється у тих випадках, коли допущена помилка і в ланцюгу, що синтезується, включений "неправильний" нуклеотид. У цьому разі фермент розпізнає дефект спарювання і вилучає зі зростаючого З'-кінця останній нуклеотид, після чого знову відновлює свою полімеразну активність. Таким чином відбувається постійний контроль системи за приєднанням кожного нуклеотиду.

Характерною рисою ДНК-полімерази ІІІ є надзвичайно висока процесивність синтезу ДНК - кількість нуклеотидів, що приєднується ферментом до зростаючого ланцюга між двома послідовними актами дисоціації його з матриці.

В еукаріотичних клітинах ідентифіковано шість типів ДНК- полімераз - α, β, γ, δ, ε та ζ, які різняться кількістю субодиниць, молекулярною масою, асоціацією з різними допоміжними білками, що прискорюють процес біосинтезу ДНК, і функціональним призначенням. ДНК-полімерази β, δ та ε не здатні ініціювати утворення дочірніх ланцюгів ДНК, оскільки не проявляють спорідненості до одиничних ланцюгів ДНК. Ініціює реплікацію ДНК-полімераза α, яка синтезує РНК-затравки довжиною від 10 до 60 нуклеотидів, а е-полімераза відповідає за синтез відстаючого ланцюга (фрагменти Оказакі). Функцією ДНК-полімерази β є поступове видалення з 5'-кінця РНК-приманки з наступним приєднанням до З'-кінця попереднього фрагменту Оказакі дезоксирибонуклеотидів у кількості, яка відповідає видаленому праймеру, і таким чином заповнює прогалину, котра виникла при видаленні рибонуклеотидів. ДНК-полімераза δ відповідає за синтез лідируючого ланцюга; їй також притаманна коригуюча 3'^5'-екзонуклеазна активність. ДНК-полімераза ζ проявляє відносно високу 3'→5'-екзонулеазну й низьку полімеразну активності, що вказує на її допоміжну коректорську роль при реплікації ДНК. ДНК-полімераза γ - мітохондріальний фермент, який здійснює синтез ДНК мітохондрій.

В активному центрі всіх ДНК полімераз (як, до речі, і РНК- полімераз) міститься іон Zn²⁺ (кофактор ферменту). При взаємодії ДНК-полімераз з субстратами необхідна присутність також іонів Mg²+, які поляризують нуклеотиди, утворюючи з ними комплекси і підвищуючи їхню реакційну здатність.

Унаслідок дії ДНК-полімераз кожний відстаючий заново синтезований ланцюг складається з окремих фрагментів, які надалі поєднуються у безперервний ланцюг. Їхнє сполучення відбувається за допомогою іншого ферменту - ДНК-лігази, який є обов'язковим учасником реплікації. Цей фермент каталізує утворення ковалентного фосфодіефірного зв'язку між 5'-кінцем фосфорильної групи одного фрагмента та З'-кінцем гідроксильної групи дезоксирибози сусіднього фрагмента. Реакція потребує високоенергетичних факторів: для ДНК-лігази E. coli потрібний НАД, а для ДНК-лігази еукаріотів - АТФ. Важливо, що фермент виявляє активність до одноланцюгових фрагментів ДНК, які знаходяться у складі дволанцюгової ДНК.

ДНК-лігази беруть також участь у сполученні (лігуванні) ланцюгів ДНК при інших матричних процесах - репарації та рекомбінації ДНК.

Топологічні перебудови ДНК. Перебудови, які відбуваються при реплікації, можуть бути пов'язані з реакціями, котрі викликають у молекулах ДНК структурні зміни.

Перш за все, при реплікації дволанцюгова ДНК повинна розкрутитися та розійтися на індивідуальні ланцюги з тим, щоб кожний із них міг функціонувати в ролі матриці. Реалізація подібних топологічних перебудов ДНК може відбуватися завдяки дії спеціальних типів білків. Так, родина зворотних нуклеаз - ДНК-топоізомераз - бере участь у регуляції надспіралізації ДНК. Молекули ДНК, що різняться за ступенем надспіральності, називаються топологічними ізом.ерами (топоізомерами). Звідси й походить назва цих ферментів.

Топоізомерази змінюють ступінь і тип надспіральності ДНК. Одні топоізомерази викликають релаксацію (ослаблення) надспіральної ДНК, а інші, навпаки, приводять до напруження, появи в ДНК надвитків. У різних організмах ідентифіковано топоізомерази двох типів:

Тип І - здатні тимчасово розривати один із двох ланцюгів ДНК. При цьому проксимальний кінець ДНК ковалентно зв'язується з ферментом, а дистальна ділянка ДНК (від місця розплетення до місця розриву) має можливість обертатися навколо інтактного (не розірваного) ланцюга ДНК. У наслідок цього кіль

кість надвитків у надспіралізованій ДНК зменшується і вона перетворюється в релаксовану форму. Ковалентний зв'язок ферменту з ДНК утримує значний запас енергії, оскільки зберігає енергію розірваного фосфодіефірного зв'язку. Звільнення ферменту приводить до швидкого з'єднання розірваних кінців ДНК і не потребує додаткової енергії.

Тип ІІ - здатні вносити тимчасові розриви в обидва комплементарні ланцюги ДНК, один із кінців яких ковалентно утримується топоізомеразою. У такому стані змінюється ступінь надспіра- лізації ДНК, після чого розірвані кінці сполучаються. Ферменти типу ІІ виявляють свою активність у присутності АТФ, гідроліз якої необхідний для здійснення конформаційних змін білка.

Руйнування водневих зв'язків у дволанцюговій молекулі ДНК здійснюється ДНК-хеліказами (англ. helix - спіраль), що створюють механічні передумови роз'єднання ланцюгів і утворення ре- плікативної вилки. Ці ферменти використовують для розплетення ланцюгів ДНК енергію, вивільнювану при гідролізі АТФ.

У підтримці розкрученого стану ділянок ДНК беруть участь тетрамерні SSB-білки (англ. single strand binding proteins - білки, що зв'язуються з одноланцюговою ДНК). Такі білки споріднено зв'язуються з одноланцюговою ДНК по всій довжині розділених ланцюгів і таким чином протидіють їхньому повторному комплементарному спарюванню. Крім того, SSB-білки зв'язуються з ДНК кооперативно, тобто за рахунок білок-білкових взаємодій тетрамери утримуються на одноланцюгових ДНК впритул один до одного, що створює умови доступності азотистих основ для комплементарного спарювання в процесі реплікації.