БИОЛОГИЯ Том 2 - руководство по общей биологии - 2004

12. МИКРОБИОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

12.6. Измерение роста бактерий и грибов в культуре

12.6.2. Общее число клеток

Гэмоцитометр

Число бактериальных или дрожжевых клеток в жидкой культуре, например в бульоне, можно прямо подсчитать с помощью микроскопа. Этот метод удобен для подсчета дрожжевых клеток, которые гораздо крупнее бактериальных. При подсчете бактерий необходим объектив с иммерсионным маслом (см. разд. 5.11.2).

Обычно для подсчета используют особое предметное стекло, называемое гемоцитометром (рис. 12.10), а сам метод известен как гемоцитометрия. Чтобы обеспечить прочный контакт между предметным стеклом и покровным стеклом, следует сильно придавить покровное стекло с любой стороны камеры (но так, чтобы не раздавить покровное стекло!). Затем покровное стекло слегка сдвигают до тех пор, пока не покажутся цветные линии (рис. 12.10). Проба жидкости, наносимая пипеткой, затягивается под покровное стекло за счет капиллярного эффекта. Камеру оставляют на 2—3 мин, чтобы клетки осели — это облегчает подсчет. Микроскоп фокусируют на решетке и подсчитывают число клеток на всей решетке, или на ее репрезентативном участке. Нужно насчитать не менее 600 клеток. Если клетки лежат на границе, их можно отнести к квадрату, ограниченному двумя сторонами (например, верхней и правой границами), и не считать их в квадрате, ограниченном двумя другими сторонами, но не следует пытаться считать половинки клеток. Каждый маленький квадрат имеет известную площадь, а глубина жидкости под покровным стеклом является постоянной (обычно 0,02 или 0,1 мм). Следовательно, можно вычислить объем каждой ячейки, и подсчитать число клеток в данном объеме. Если число клеток в каждом квадрате превышает 30, следует развести пробу. Не забывайте при расчетах сделать поправку на разведение.

На решетке, изображенной на рис. 12.10, каждый маленький квадрат имеет размеры 0,05 мм х 0,05 мм = 0,0025 мм² на общей площади решетки 1 мм². Если зазор между покровным стеклом и решеткой составляет 0,02 мм, то общий объем над решеткой равен 1 х 0,02 мм = 0,02 мм³. Можно, следовательно, подсчитать число клеток в данном объеме пробы. Запомните, что 1000 мм³ = 1 см³, а 1000 см³ = 1 дм³ (1 л).

При подсчете клеток дрожжей можно использовать краситель метиленовый синий. При этом в синий цвет окрашиваются только мертвые клетки. Живые клетки активно выводят краситель из клетки. Таким образом, можно подсчитать число жизнеспособных клеток, если учитывать только бесцветные или бледно-голубые клетки.

Рис. 12.10. Гемоцитометрия.

Измерение мутности

Метод, называемый нефелометрией, в принципе прост. Чем больше клеток в суспензии, тем выше ее мутность, или «затемненность», степень которой можно измерить.

Проще всего использовать набор стандартных пробирок (броуновские пробирки), которые имеются в продаже. Они содержат суспензии сульфата бария в различных концентрациях, от прозрачной (пробирка 1) до непрозрачной (пробирка 10). Образец суспензии исследуемых микроорганизмов помещают в идентичную пробирку и подбирают одну из стандартных пробирок, подходящую по мутности суспензии. К набору стандартных пробирок прилагается таблица, позволяющая по мутности рассчитать концентрации клеток для широкого спектра различных микроорганизмов.

Можно также мутность измерять как долю пропускания света (или оптическую плотность) суспензией с использованием колориметра или спектрофотометра. Клеточная масса прямо пропорциональна оптической плотности. Лучше всего использовать красный свет (красный фильтр), поскольку он не интерферирует с желтоватым цветом многих культуральных сред.

При измерении мутности возможны ошибки, если растущие клетки образуют комки (см. раздел, посвященный подсчету жизнеспособных клеток). Наиболее точные результаты получают в тех случаях, когда плотность популяции не слишком высокая и не слишком низкая. Для получения идеальной плотности клеток (10⁶ - 10¹⁰ клеток · см^-3) иногда требуется разведение проб.