БИОЛОГИЯ Том 3 - руководство по общей биологии - 2004

25. ПРИКЛАДНАЯ ГЕНЕТИКА

25.1. Генная инженерия бактерий

25.1.2. Этап 1. Получение копии нужного гена

Это самая трудная часть процесса. Например, в геноме человека (геном — это вся ДНК в клетке) насчитывается около 3 млрд, нуклеотидов и = 100 000 генов (по последним данным ≈ 30 000). Типичный ген имеет несколько тысяч пар нуклеотидов в длину, так что даже найти конкретный ген не так просто. Для получения копии гена используют три метода:

1) с помощью обратной транскриптазы получают копию гена на матрице его мРНК;

2) синтезируют искусственный ген;

3) используют метод «дробовика» («shotgun»), включающий разрезание ДНК рестрикционными ферментами (рестриктазами) и поиск фрагмента, содержащего нужный ген.

Методику генной инженерии мы проиллюстрируем сначала на примере использования двух первых методов, которые прямо ведут к цели, т. е. позволяют выделить нужный ген. Затем мы рассмотрим третий метод.

Использование обратной транскриптазы

Несмотря на то, что в диплоидной клетке есть только две копии каждого гена (одна — в хромосоме, которая получена от матери, другая — в хромосоме, полученной от отца), активно функционирующий ген обычно образует тысячи комплементарных молекул мРНК (разд. 23.8). Чаще всего известно, в каких клетках данный ген активен. Например, ген, кодирующий инсулин, активен в β-клетках поджелудочной железы. Ретровирусы содержат фермент, который может синтезировать на молекуле РНК комплементарную копию ДНК. Получение ДНК на матрице РНК — это процесс, который противоположен нормальной транскрипции, когда РНК синтезируется на матрице ДНК, поэтому фермент назвали обратной транскриптазой. Он стал ценным инструментом генной инженерии. (Сами ретровирусы используют этот фермент для того, чтобы превратить собственный геном, состоящий из РНК, в ДНК, которая способна инфицировать новые клетки; разд. 2.4.5.) Если известно, в каких клетках активен интересующий нас ген, выделить из этих клеток мРНК несложно. Когда эта задача выполнена, мРНК с помощью обратной транскриптазы превращают в ДНК-копию нужного гена (рис. 25.1). Полученную таким способом ДНК называют комплементарной ДНК, или кДНК, независимо от того, является она одноцепочечной или двухцепочечной.

Рис. 25.1. Генная инженерия. Схема процедуры, разработанной для клонирования генов. Детали объясняются в тексте.

Синтез гена

Последовательность оснований в гене можно определить либо непосредственно, либо исходя из аминокислотной последовательности белка, кодируемого этим геном. Затем можно сконструировать ген из нуклеотидов (напомним, что каждое основание является частью одного нуклеотида), соединив их друг с другом в правильном порядке. Сейчас таким способом удается конструировать только короткие гены, однако с усовершенствованием методов синтез любого гена станет рутинной процедурой. Этот метод был использован для получения генов проинсулина и соматостатина. Соматостатин (известный также как ингибитор гормона роста) — это белковый гормон, состоящий всего из 14 аминокислот.

Метод «дробовика» - использование рестрикционных ферментов

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restricting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, «нуклеаза») в строго определенных точках («эндо» означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отношении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метальной группы.

Название каждого фермента происходит от названия бактерии, из которой его выделяют (рис. 25.2). Обратите внимание на то, что рестрицируемая последовательность-мишень часто имеет шесть оснований в длину и является палиндромной, т. е. читается одинаково в обоих направлениях. Рассматривая рис. 25.2, помните, что две комплементарные цепи ДНК считываются в противоположных направлениях. Некоторые рестриктазы производят ступенчатые надрезы. В результате их действия образуются фрагменты ДНК с выступающими одноцепочечными концами (например, EcoRI, (рис. 25.2). Такие концы называются «липкими»; их используют для воссоединения фрагментов ДНК. Они как бы слипаются за счет образования водородных связей с комплементарными липкими концами других молекул ДНК, разрезанных той же рестриктазой (рис. 25.1). Например, широко используемая рестриктаза EcoRI образует липкий конец — ТТАА. Есть рестриктазы, формирующие тупые концы. К ним относится, например, HindII (рис. 25.2). С помощью рестриктаз ДНК любого организма можно фрагментировать. Длина образовавшихся рестрикционных фрагментов зависит от типа используемой рестрикционной эндонуклеазы и от того, где расположены последовательности оснований, которые узнаются данным ферментом (рис. 25.3).

Рис. 25.2. Некоторые обычно используемые рестриктазы. EсоRI, HindIII и ВаmНI делают зигзагообразные (ступенчатые) разрезы в ДНК, оставляя «липкие концы». Липкий конец, образованный, к примеру, EсоRI, может соединиться с другим липким концом, образованным EсоRI. HindII и НраI оставляют тупые концы. Более детально представлены схемы для EсоRI и НраI.

Рис. 25.3. Использование рестриктаз для разрезания ДНК и получения рестрикционных фрагментов разной длины. На этом рисунке участок ДИК, который содержит два гемоглобинавых гена разных приматов, обрабатывали двумя рестриктазами. Фермент 1 обозначен знаком фермент 2 — знаком ↓. Фермент 1 разрезает ДНК человека на два фрагмента, а фермент 2 — на пять фрагментов. Длины этих фрагментов, а также фрагментов, полученных при совместной обработке обоими ферментами, позволяют локализовать положение разрезов (сайтов рестрикции) относительно друг друга. На основе этих данных строят «рестрикционную карту», которая изображена на схеме. Чем больше рестриктаз используется для построения карты, тем более детальной она получается. Обратите внимание на то, что чем ближе родство между видами, тем более сходны их ДНК и расположение в них сайтов рестрикции. [Схема построена на основе рис. 7—4, с. 294, Molecular biology of the cell, 3rded., B. Alberts et al. (1994) Garland.]

Известно, что каждый нуклеотид в ДНК несет фосфатную группу, которая заряжена отрицательно, поэтому фрагменты ДНК различной длины заряжены неодинаково. Эти различия можно использовать для разделения фрагментов ДНК в электрическом поле методом гель-электрофореза (рис. 25.4). Как следует из названия метода, он предполагает использование агарозного (для очень больших фрагментов) или полиакриламидного (для фрагментов меньших размеров) геля. Поскольку ДНК бесцветна, положение того или иного фрагмента в геле после электрофореза выявляют либо с помощью окрашивания, либо используя радиоактивно меченную ДНК и проводя радиоавтографию, в ходе которой на гель накладывают фотографическую пленку. Радиоактивное излучение засвечивает пленку в том месте, где расположена ДНК.

Рис. 25.4. Гель-электрофорез, используемый для разделения фрагментов ДНК различной длины. Фрагменты образуются при разрезании ДНК одной или несколькими рестриктазами. Самые большие фрагменты движутся медленнее всех, так как им гораздо труднее пройти через поры в геле. На фотографии они расположены поблизости от стартовых лунок в геле.

При обработке ДНК донорного организма рестриктазами рассчитывают на то, что один из фрагментов будет случайным образом содержать полную копию нужного гена и ничего больше. Этот неспецифичный метод выделения генов называют методом дробовика. Наиболее трудная задача при его использовании — найти фрагмент, который несет нужный ген; эта проблема обсуждается в разд. 25.1.3.

Прерывистые гены

Использование обратной транскриптазы или химический синтез гена имеют преимущество над методом дробовика, поскольку получаемый при этом ген не является «прерывистым». Прерывистые гены содержат один или несколько участков ДНК, называемых нитронами, которые не кодируют аминокислотную последовательность белка. Функция интронов до сих пор не ясна. Известно лишь, что если эукариотический ген, содержащий интроны, поместить в бактерию, то бактерия синтезирует бесполезный белок, поскольку у бактерий нет ферментов для удаления интронов из мРНК. Как интроны удаляются из мРНК, показано на рис. 25.5.

Рис. 25.5. Транскрипция и трансляция гена, содержащего интрон. Участки, окружающие интрон, называются экзонами. Гены могут содержать много нитронов. Белки кодируются только экзонами.