БИОЛОГИЯ Том 3 - руководство по общей биологии - 2004

25. ПРИКЛАДНАЯ ГЕНЕТИКА

25.1. Генная инженерия бактерий

25.1.3. Этап 2. Встраивание генов в вектор

Как уже объяснялось выше, в качестве векторов чаще всего используют плазмидную ДНК или фаговую ДНК. Сначала рассмотрим схему встраивания в плазмидную ДНК. В принципе та же процедура применяется и в случае фаговой ДНК.

Плазмидная ДНК

Кольцевые молекулы плазмидной ДНК у бактерий гораздо меньше, чем основная хромосомная ДНК, поэтому их можно легко отделить друг от друга. Бактериальные клетки разрушают и центрифугируют. При этом хромосомная ДНК оказывается в осадке, а плазмидная ДНК остается в жидкой фазе над осадком. Перед обработкой рестриктазами плазмидную ДНК очищают (рис. 25.1).

Если для выделения донорной ДНК (например, методом «дробовика») использовали рестриктазу, той же самой рестриктазой должна быть обработана плазмидная ДНК. Рестрикционные фрагменты донорной ДНК, среди которых есть и фрагмент с нужным геном, смешивают затем с плазмидной ДНК. При смешивании они соединяются липкими концами. Например, липкий конец —ААТТ будет соединяться с комплементарным липким концом —ТТАА. Вначале соединение происходит за счет водородных связей, но после добавления фермента, называемого ДНК-лигазой, образуются фосфодиэфирные связи.

Если в качестве донорной ДНК используется кДНК или синтетический ген (см. выше два первых метода выделения генов), то для встраивания ДНК в вектор следует действовать по схеме, представленной на рис. 25.6. Та же процедура необходима, если при использовании метода «дробовика» применялся фермент, образующий тупые концы.

Рис. 25.6. Добавление липких концов к фрагменту ДНК, имеющему тупые концы, перед встраиванием ДНК в вектор с целью создания рекомбинантной молекулы ДНК.

Фаговый вектор

Преимуществом фагов как векторов является возможность клонирования больших фрагментов ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой цели используют фаг λ (рис. 2.20). Часть фаговой ДНК заменяют на ДНК, которую нужно клонировать. Эта часть не нужна для репликации фаговой ДНК в бактериальной клетке-хозяине, поэтому клонирование не нарушается. Схематически эта процедура представлена на рис. 25.7.

Часто в ней используют донорную ДНК, полученную методом «дробовика».

Рис. 25.7. Включение ДНК в фаговый вектор.