БИОЛОГИЯ Том 3 - руководство по общей биологии - 2004

25. ПРИКЛАДНАЯ ГЕНЕТИКА

25.1. Генная инженерия бактерий

25.1.6. Отбор бактерий, содержащих нужный ген

Если на первом этапе клонирования использовался метод «дробовика», то бактерии, включившие донорную ДНК, совсем не обязательно будут нести фрагмент ДНК с нужным геном. Донорная ДНК представляет собой смесь очень большого числа рестрикционных фрагментов (в случае ДНК человека — до миллиона). Даже в том случае, когда все эти фрагменты клонируются, нужный ген или участок ДНК будет содержать только один из них или несколько. Смесь клонов, полученных таким путем, называется библиотекой. Библиотеку можно также получить, если на первом этапе использовать обратную транскриптазу и смесь мРНК. Иногда это приходится делать, если нужную мРНК нельзя выделить в чистом виде. Таким образом, в тех случаях, когда клонировался не одиночный ген (синтезированный или считанный с мРНК одного типа), после четвертого этапа получают бактериальные культуры в виде библиотек.

Использование зондов

Нужную бактерию отбирают с помощью зонда, как это показано на рис. 25.9. Зонд можно использовать, если известна полная или частичная последовательность ДНК, которую требуется найти. Если же известна аминокислотная последовательность белка, который кодируется данным геном, то по ней можно предсказать последовательность нуклеотидов (по крайней мере, очень близкую к ней). В качестве зондов используют короткие фрагменты ДНК и РНК, которые комплементарны участку нужного гена и поэтому связываются с ним. Например, зонд АГТЦЦА найдет и присоединится с помощью водородных связей к последовательности ТЦАГГТ. Зонды могут быть очень короткими (15—20 нуклеотидов) или более длинными. Обычно зонд изготавливают из нуклеотидов, меченных радиоактивным элементом ³²Р. При связывании зонда с ДНК радиоактивность является маркером, который выявляют методом радиоавтографии (рис. 25.9).

Рис. 25.9. Скрининг библиотеки с помощью ДНК-зонда с целью обнаружения клона.