БИОЛОГИЯ Том 3 - руководство по общей биологии - 2004

25. ПРИКЛАДНАЯ ГЕНЕТИКА

25.1. Генная инженерия бактерий

25.1.5. Этап 4. Клонирование ДНК

Одна-единственная фаговая частица, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК, может менее чем за один день образовать более 10¹² идентичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки Е. coli, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашках Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со временем образуя видимые колонии. При этом появляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтезируются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают миллиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейшее клонирование, нужно провести отбор трансформированных бактерий.

Отбор трансформированных бактерий

Рассмотрим ситуацию, когда в качестве вектора были использованы плазмиды. Когда плазмидную ДНК смешивают с бактериальной культурой, возникают две проблемы. Во-первых, не все бактерии трансформируются (получают плазмиды). Во-вторых, не все плазмиды несут чужеродную донорную ДНК. Эти проблемы искусно обходят, используя плазмиды, которые обладают двумя особыми свойствами (рис. 25.8).

1. Плазмиды несут ген устойчивости к определенному антибиотику. Если в питательную среду, на которой выращивают бактерии, добавить этот антибиотик, то размножаться и формировать колонии смогут только трансформированные клетки (те, которые содержат плазмиды).

2. Плазмиды несут ген, кодирующий фермент β-галактозидазу, причем этот ген дополнительно содержит несколько сайтов рестрикции, которые не влияют на функцию гена. β-Галактозидаза — это фермент, расщепляющий лактозу на галактозу и глюкозу. При действии данного фермента на бесцветное вещество X-gal образуется продукт голубого цвета. Если чужеродная ДНК встроена в сайт рестрикции внутри гена, то ген не будет работать. Поэтому, если бактерии, которые выросли в присутствии антибиотика, выращивать затем на среде с X-gal, то колонии, не содержащие донорной ДНК, будут окрашены в голубой цвет. Бактерии же, образующие бесцветные колонии, содержат донорную ДНК, и их можно отбирать для последующего клонирования.

Рис. 25.8. Плазмидный вектор, содержащий ген устойчивости к антибиотику ампициллину. Благодаря присутствию такого гена мы имеем возможность на среде с ампициллином отбирать клетки, несущие плазмиду. Клетки, не содержащие плазмиду, на такой среде погибают.