ПРАКТИКУМ З ГІСТОЛОГІЇ, ЦИТОЛОГІЇ ТА ЕМБРІОЛОГІЇ - 2016
Розділ 1. ГІСТОЛОГІЧНА ТЕХНІКА.
Гістологія - це наука про тканини i клітини органів i систем багатоклітинних організмів. Гістологія складається з окремих розділів. Вчення про клітину називається цитологією. Загальна гістологія вивчає будову тканин. Спеціальна гістологія присвячена вивченню структури органів і систем організму. У курсі гістології клітини і тканини вивчаються в процесі їхнього виникнення і розвитку, тому ембріологія, як наука про розвиток зародка, є складовою частиною гістології.
Цитологія, гістологія і ембріологія користуються спеціальними методами дослідження, які можна об'єднати спільною назвою - гістологічна техніка. Усі ці методи потребують застосування мікроскопа і тому вони називаються мікроскопічними методами.
Основними етапами гістологічного аналізу є вибір об'єкту, його підготовка до вивчення, дослідження під мікроскопом, якісний і кількісний аналіз, відображення результатів.
Об'єктом дослідження можуть бути живі і мертві (фіксовані) клітини і тканини. Вивчення живих тканин і клітин здійснюється за допомогою вітальних або суправітальних, а фіксованих - поствітальних методів. Останні потребують виготовлення постійного гістологічного препарату. Гістологічними препаратами (мікропрепаратами) називаються виготовлені з тканин (органів) забарвлені зрізи, плівки, мазки, відбитки, окремі клітини, які помістили на предметне скло, залили тонким шаром прозорої речовини і покрили покривним склом (рис.1). Основними етапами виготовлення гістологічного препарату є: отримання матеріалу, його фіксація, промивання, зневоднення, ущільнення, заливка, виготовлення і забарвлення зрізів.
Отримання матеріалу. Матеріал - шматочки тканини або органа - гострими ножицями або лезом вирізається так, щоб уникнути зайвого травмування. Об'єм шматочків - приблизно 0,5 — 2,0 см3. Матеріал повинен бути свіжим, тобто брати його треба якнайшвидше після смерті людини або експериментальної тварини.
Фіксація матеріалу. Забраний шматочок занурюється у фіксуючу рідину - фіксатор. Об'єм фіксатора має перевищувати в 50 - 100 разів об'єм шматочка. Фіксатори бувають простими і складними. Найбільш поширеним є простий фіксатор - 10% розчин формаліну. Використовується також етиловий і метиловий спирти, розчини солей важких металів, оцтова, пікринова, осмієва кислоти та інші. Складні фіксатори - це суміші, що складаються з окремих компонентів у визначених співвідношеннях. Наприклад, рідина Ліллі (96°спирт, формалін, льодяна оцтова кислота), рідина Карнуа (абсолютний спирт, хлороформ, льодяна оцтова кислота) тощо.
Рис.1. Гістологічні препарати.
А - забарвлений зріз на предметному склі.
Б - той самий зріз, накритий покривним склом.
Фіксацію можна проводити при кімнатній температурі, а в разі використання гістохімічних методів дослідження - при зниженій температурі. Термін фіксації залежить від властивостей фіксатора, розмірів об'єкта - від кількох хвилин до кількох діб.
Застосування різних фіксаторів обумовлене метою фіксації, тобто збереження прижиттєвого стану морфологічних структур тканини або органа на момент смерті організму з найменшими змінами внаслідок фіксації. Фіксація матеріалу полегшує в подальшому сприйняття об'єктами барвників і запобігає процесам гниття.
Промивання матеріалу. Після фіксації матеріал звичайно промивається проточною водою протягом 24 - 48 годин для видалення фіксатора.
Зневоднення і ущільнення матеріалу. Мета цих етапів - видалення води з шматочків і підготовка їх до виготовлення тонких зрізів.
Зневоднення шматочків, які фіксувалися у водних розчинах, проводиться поступово в спиртах наростаючої концентрації: 50о, 60о, 70о, 80о, 100о (абсолютний спирт). Останній отримують з 96о спирту шляхом його зневоднення мідним купоросом або перегонкою через мармурову кришку. Термін перебування шматочків у спиртах різної концентрації залежить від об'єкта і його розмірів (від кількох годин до кількох діб).
Ущільнення матеріалу досягається просоченням шматочків рідкими середовищами, які можуть ставати твердими (парафін, целоїдин). Оскільки вказані речовини розчиняються в ксилолі,
бензолі або толуолі, то шматочки спочатку занурюють у суміш спирту з ксилолом (1:1), потім у дві - три порції чистого ксилолу, далі - у суміш ксилолу з парафіном при 55°С - 56°С. Для заливки матеріалу і виготовлення блоків використовують металеві, паперові або керамічні формочки.
Виготовлення зрізів. Із парафінових або інших блоків на спеціальному приладі - мікротомі, можна зробити тонкі (завтовшки 5 - 7 мкм) зрізи. Для цього користуються мікротомними ножами. Потім зрізи збирають і прикріплюють до предметного скла, попередньо змазаного сумішшю білка курячого яйця і гліцерину (1:1).
Зрізи для гістохімічного дослідження можна зробити на заморожуючому мікротомі або на мікротомі-кріостаті. Мікротом- кріостат - це фреонова холодильна установка, до камери якої вмонтовано мікротом. Робоча температура в камері (від 0оС до - 20оС) підтримується автоматично. У кріостаті є можливість отримати тонкі зрізи з нефіксованої тканини.
Тонкі зрізи є прозорими і для того, щоб розрізнити деталі будови тканини або органа, їх треба забарвити.
Забарвлення зрізів. Існує багато методів забарвлення зрізів, для чого застосовується більше трьох тисяч барвників. Гістологічні барвники умовно можна розділити на загальні і спеціальні; за походженням - на рослинні, тваринні і синтетичні; за хімічними властивостями - на основні, кислі і нейтральні.
Загальні барвники використовуються для вивчення загальної морфології клітин, тканин і органів. До ядерних барвників належать гематоксилін, кармін, азур II, сафранін. Гематоксилін виготовляють з кори кампешевого дерева, яке росте в Південній Америці. Він забарвлює ядра в синьо-фіолетовий колір. Кармін - це екстракт яйценосних комах кошенілі, забарвлює ядра в ясно-червоний, сафранін - у темно-червоний, азур II - у фіолетовий колір. Це основні катіонні барвники, які містять позитивно заряджені атоми азота. Гістологічні структури, що забарвлюються основними барвниками, називаються базофільними.
Цитоплазматичні барвники - еозин, еритрозин, кислий фуксин - забарвлюють цитоплазму в різні кольори, найчастіше в різні тони червоного кольору. За хімічними властивостями вони є кислими, або аніонними, за походженням - синтетичними. Структури, які здатні забарвлюватися кислими барвниками, називаються оксифільними (ацидофільними, еозинофільними).
Нейтральні барвники - це суміші барвників, що містять кислі і основні компоненти.
Спеціальні барвники вибірково забарвлюють певні речовини або структури. Наприклад: Судан III забарвлює ліпіди в оранжевий колір, орсеїн - еластичні волокна в бурий колір тощо.
Виявити гістологічні структури можна також методом імпрегнації. Це метод обробки шматочків або зрізів розчинами солей важких металів із наступним їхнім відновленням.
Процедура забарвлення зрізів починається з їхньої депарафінізації, тобто обробки ксилолом або толуолом, подальшому проведенні через спирти все меншої концентрації. Далі, згідно прописів для кожного методу, зрізи обробляють у певній послідовності розчинами барвників. Після забарвлення зрізи зневоднюють у спиртах наростаючої концентрації і поміщають у прозоре середовище - канадський бальзам або полістирол, які мають показники заломлення, подібні до скла.
Гістологічні препарати, виготовлені з дотриманням вищезазначених вимог, можуть зберігатись дуже довго.