ГЕНЕТИКА - Підручник - А.В. Сиволоб - 2008

РОЗДІЛ 9. Генетична інженерія і методи молекулярної генетики

ГЕННА ТЕРАПІЯ

Концепція генної терапії полягає в тому очевидному твердженні, що найрадикальнішим способом боротьби з різного роду захворюваннями, викликаними змінами генетичної інформації клітин, має бути виправлення або знищення самої генетичної причини захворювання, а не її наслідків. Такою може бути мутація в зародковій лінії клітин, яка передається нащадкам; або соматична мутація, що викликає, наприклад, злоякісну трансформацію; або поява в клітині чужорідного генетичного матеріалу унаслідок вірусної інфекції. Спосіб боротьби із цими генетичними змінами полягає в штучному введенні в постраждалу клітину нової генетичної інформації, покликаної виправити ту, з якою пов'язана хвороба. Історично генна терапія спочатку націлювалася на лікування спадкових генетичних захворювань, однак згодом поле її застосування, принаймні теоретично, розширилося таким чином, що вона стала розглядатися як потенційно універсальний підхід до лікування практично всього спектра хвороб.

Стратегії генної терапії можна розділити на три великі блоки. Стратегія першого типу використовується в тих випадках, коли клітини, які потрібно вилікувати, втратили функцію певного гена. Тоді в клітину, що страждає від втрати функції, потрібно доставити ген, здатний забезпечити її. Часто хвороба, навпаки, викликається надлишковою функцією, не властивою нормальній клітині. Це, зокрема, відбувається при інфекціях або пухлинних трансформаціях. Тоді варто сконцентрувати увагу на пригніченні зайвої функції. Ці дві стратегії можна вважати суто генно-терапевтичними: вони спрямовані на корекцію дефекту клітини шляхом 'її генетичної модифікації. Підходами третього типу є такі, що спрямовані на підсилення імунної відповіді організму на небажані явища. При цьому також здійснюється генетична модифікація або тих клітин, проти яких хочуть збільшити імунну відповідь, або клітин імунної системи, за допомогою котрих хочуть підсилити цей ефект.

Існує кілька способів уведення нової генетичної інформації в клітини ссавців. Зазвичай використовують два основні підходи, які різняться природою клітин-мішеней:

1) фетальна генотерапія - при якій чужорідну ДНК уводять у зиготу або ембріон на ранній стадії розвитку; при цьому очікується, що введений матеріал потрапить в усі клітини реципієнта, у тому числі - статеві, забезпечивши тим самим передачу наступному поколінню);

2) соматична генотерапя - у цьому разі генетичний матеріал уводять тільки в соматичні клітини і він не передається статевим клітинам.

Є й третій підхід - активація власних генів організму з метою повного або часткового подолання дії мутантного гена. Яскравим прикладом такого підходу є використання гідроксисечовини для активації синтезу гемоглобіну F у хворих із серповидноклітинною анемією та таласеміями.

Більшість методів фетальної генотерапії розроблені на трансгенних мишах і вони дають іноді непогані результати. Але низький вихід трансгенних тварин, небезпека ушкодження генів хазяїна при неадресному вбудовуванні чужорідної ДНК, а також зрозумілі етичні проблеми роблять фетальну генотерапію поки що не актуальною.

Щодо соматичної генотерапії, то сьогодні на стадії розробки (а іноді й клінічних випробувань) існує кілька сотень проектів, спрямованих на лікування онкологічних, інфекційних (СНІД, гепатит, туберкульоз) і спадкових захворювань.

Є різні методи введення чужорідної ДНК у клітини-мішені - вибір частково залежить від захворювання. Доставку генетичного матеріалу здійснюють, застосовуючи вектори на основі вірусів (ретровірусів, не здатних до самостійної реплікації, аденовірусів, герпесвірусів тощо) або за допомогою безвекторних систем, зокрема ліпосом. Існує два підходи соматичної генотерапії. Перший - генна терапія ex vivo: спочатку генетичний матеріал уводять у клітини, які вирощують у культурі, а потім трансгенні клітини вводять реципієнтові. Другий - генна терапія in vivo: вектор, що несе потрібний ген, уводять безпосередньо в організм реципієнта. Перший підхід особливо ефективний, якщо для доставки використовують стовбурові кровотворні та інші клітини, які вдається виростити в культурі у великих кількостях.

До 80 % усіх сучасних розробок генної терапії припадають на пухлинні захворювання. Як найбільш перспективні сьогодні розглядають такі напрямки боротьби з онкологічними захворюваннями: 1) збільшення імуногенності пухлинних клітин, наприклад, шляхом уведення генів, що кодують чужорідний для цих клітин антиген;

2) уведення в пухлинні клітини "генів-убивць", які запускають програму загибелі або відповідають за синтез продукту, що приводить у певних умовах до загибелі пухлинних клітин; 3) блокування експресії онкогенів шляхом, скажімо, уведення в клітини конструкцій, які кодують синтез антизмістовних РНК або антитіл до онкобілків; 4) захист стовбурових клітин від токсичних ефектів хіміотерапії шляхом уведення в них генів стійкості до ліків.

Особливе місце посідають розробки, спрямовані на боротьбу зі СНІДом. СНІД - незвичайне інфекційне захворювання, оскільки в цьому випадку генетичний матеріал збудника потрапляє в геном і залишається там до кінця існування клітини. Сьогодні використовують два головні підходи для генотерапії СНІДу: внутрішньоклітинну імунізацію та підвищення імунності проти вірусу з використанням генетично модифікованих клітин. Термін "внутрішньоклітинна імунізація" означає процес створення клітин, здатних продукувати внутрішньоклітинні антитіла проти збудника після введення в клітину відповідної генетичної інформації. Внутрішньоклітинні антитіла відкривають унікальний засіб впливу зсередини клітини на будь-які внутрішньоклітинні об'єкти - білки, цукри або нуклеїнові кислоти.

Для багатьох інфекційних збудників показано, що існують певні лінії їхніх клітин-хазяїв, які не інфікуються або не підтримують реплікацію даного збудника. Так, у 10 % представників європеоїдної раси є мутантний вірусний корецептор СКД5 і гомозиготні за відповідним геном індивідууми не інфікуються ВІЛ-1. Запропоновано декілька варіантів використання цих даних для боротьби з інфекцією: запобігання інфекції шляхом блокування рецепторів, пригнічення експресії корецептора або його спрямована делеція.

У багатьох випадках захворювання, у тому числі й інфекційні, пов'язані з надлишковим синтезом нормального білка. Для лікування таких патологій розроблено терапевтичні системи з використанням антизмістовних олігонуклеотидів. Невеликий олігонуклеотид може гібридизуватися з комплементарною мРНК і знижувати рівень експресії білка, що відповідає за виникнення патології. Аналогічно можуть бути використані дволанцюгові РНК, що діють за механізмом РНК-інтерференції (див. розділ 2), блокуючи синтез білка на рибосомі. На відміну від антизмістовних РНК, дволанцюгові РНК - інструмент багаторазового використання, оскільки ампліфікуються в клітині РНК-залежною РНК-полімеразою.

Нарешті, одним із найважливіших напрямків застосування методів молекулярної генетики в медицині є молекулярна діагностика спадкових захворювань, у тому числі - до народження (пренатальна діагностика). Гени практично всіх спадкових захворювань уже відомі, методи їхнього визначення широко застосовуються в медицині з метою запобігти народженню хворої дитини. Методи молекулярної діагностики дозволяють виявити не тільки гени спадкових (моногенних) захворювань (гемофілія, муковісцидоз, міодистрофія Дюшенна, фенілкетонурія тощо), а й гени схильності до того чи іншого захворювання: хвороб, які розвиваються у старечому віці (хвороба Альцгеймера, рак молочної залози, нейродегенеративні хвороби), і таких, що виникають за дії певних зовнішніх факторів (діабет, атеросклероз, деякі онкологічні захворювання). Молекулярна діагностика дає можливість поставити діагноз задовго до появи симптомів і, відповідно, розпочати профілактику або лікування.

Розвиток методів геноміки дозволить у майбутньому проводити тотальну "генетичну паспортизацію» з метою виявлення індивідуальних ризиків кожної людини. Одним із найважливіших результатів робіт із секвенування геному людини стало суттєве вдосконалення методичних підходів. Нещодавно було здійснено секвенування першого індивідуального геному - геному Джеймса Уотсона, людини, яка стояла на початку молекулярної генетики. Цей геном було встановлено методом піросеквенування за два місяці, що коштувало менше 1 млн доларів (для порівняння: загальне фінансування проекту "Геном людини" з боку американського уряду становило близько 3 млрд доларів за 11 років). Швидкий розвиток сучасних технологій геноміки робить секвенування індивідуальних геномів кожної людини реальністю у близькому майбутньому.