ГЕНЕТИКА - Підручник - А.В. Сиволоб - 2008

РОЗДІЛ 5. Генетика бактерій, вірусів і одноклітинних еукаріотів

ОДНОКЛІТИННІ ЕУКАРІОТИ

Дріжджі

Дріжджі, з одного боку, - еукаріоти, з усіма притаманними їм особливостями (див. розділ 6). З іншого боку, це найпростіші з еукаріотів, що робить їх (у першу чергу, Saccharomycescerevisiae) популярним модельним об'єктом дослідження в генетиці, молекулярній біології, біології клітини, а також у біотехнології - подібно до бактерій, дріжджі швидко розмножуються й досить легко піддаються культивуванню та трансформації (уведенню чужорідної ДНК, див. розділ 9).

Геном S. cerevisiae містить ~12 млн пар основ (16 хромосом у гаплоїдному наборі; крім хромосомної ДНК, дріжджі, подібно до бактерій, часто мають у своєму складі також автономні плазміди). Трохи більше 1 % геному становлять послідовності, що повторюються в центромерних і теломерних зонах хромосом, дещо більше 2 % - мобільні елементи (так звані Ty-елементи, які відносять до класу LTR-ретропозонів - див. розділ 6). Узагалі послідовності, що повторюються (включаючи гени рРНК і тРНК) дорівнюють ~10 % геному. На кодуючі послідовності ~6,7 тис. білкових генів припадає близько 70 % геному. Середній розмір кодуючої послідовності - 480 кодонів (варіює від 40 до 5 тис.). Тільки близько 3,5 % генів містять інтрони у своєму складі. Отже, геном S. cerevisiae є очевидною перехідною ланкою між геномами прокаріотів і вищих еукаріотів (див. табл. 1.1; розділ 6).

Цикл розвитку S. cerevisiae зображено на рис. 5.10. Диплоїдна клітина здатна розмножуватись брунькуванням: відбувається мітоз, поділ ядра, формування клітинної стінки та поділ клітин. В умовах нестачі поживних речовин здійснюється споруляція, коли диплоїдна клітина розділяється шляхом мейозу. Чотири гаплоїдні нащадки утворюють аскоспори, що інкапсулюються разом у структуру, яку називають аском. Споруляція є можливою тільки для диплоїдних клітин, гетерозиготних за локусом МАТ, - таких, що несуть два алелі цього локусу, які позначаються як МАТа й МАТα. Відповідно, утворюються гаплоїдні аскоспори двох типів: а та α.

Тип спори є так званим типом спарювання, або своєрідною "статтю" гаплоїдних клітин. При перенесенні аска на поживне середовище відбувається розмноження спор вегетативним шляхом, а також спарювання між "різностатевими" спорами з утворенням диплоїдної клітини. Використовуючи аски різних штамів, можна проводити схрещування між ними й досліджувати їхні результати методами генетичного аналізу. Для отримання "гібридних" штамів зазвичай використовують комплементарні генетичні маркери: наприклад, якщо клітини одного

штаму не розмножуються на середовищі без триптофану, а іншого - потребують гістидин, то на відповідному середовищі можна відібрати "гібридні" диплоїдні колонії.

Рис. 5.10. Життєвий цикл аскоміцета Saccharomyces cerevisiae

Якщо ізолювати окрему аскоспору, то її потомство, яке виникне за рахунок брунькування, має складатися з клітин одного типу. Проте такий штам не буде насправді моноспоровим, якщо в нього присутній ген НО, який забезпечує перемикання типів клітин: клітина а утворює бруньку типу а (або навпаки). Звичайно, у цьому випадку клітини різного типу, що накопичуються, будуть спарюватися з утворенням диплоїд- них гетерозигот, які врешті-решт і будуть переважати в культурі.

Перемикання типів клітин у S. cerevisiae є прикладом програмованої геномної перебудови. Локус МАТ розташований у правому плечі третьої хромосоми: елемент послідовності Ya або Ya, який визначає алельну форму локусу, фланкований кількома іншими елементами з обох боків (рис. 5.11, де зображено конфігурацію, що відповідає алелю МАТа). Поблизу від лівої та правої теломер є дві так звані касети, що являють собою алелі а та а відповідно. Але касети (позначаються як HMLa та HMLa) знаходяться у субтеломерних гетерохроматинових зонах, і тому не експресуються - вони недоступні для системи транскрипції внаслідок додаткової компактизації хроматину (див. розділ 6).

При перемиканні типів клітин спрацьовує ген НО, який кодує специфічну нуклеазу. Нуклеаза НО розрізає локус МАТ у зоні елемента Ya (або Ya). Наступні події еквівалентні схемі гомологічної рекомбінації (порівн. рис. 5.11 і 1.25): дволанцюговий розріз розширюється з утворенням двох З'-кінцевих одноланцюгових хвостів, у хромосомі утворюється петля й гомологічна касета HMLa підводиться до зони розрізу, відбувається репараційний синтез ДНК на ланцюгах ДНК касети. Результатом є конверсія гена: заміна локусу МАТа на локус МАТа. Обидві касети при цьому залишаються в незмінному вигляді, і в майбутніх поколіннях ліва касета може бути використана для зворотного перемикання локусу МАТа на МАТα.

Рис. 5.11. Схема перемикання типу спарювання у S. cerevisiae.

Якщо в центрі міститься локус МАТа, для конверсії використовується касета HMLa

Результатом синтезу ДНК, що зображено на вставці рис. 5.11, буде утворення двох структур Холідея (порівн. рис. 1.26). Як пояснювалось у розділі 1, є два рівноймовірні шляхи розділення цих структур: із кросинговером між двома дуплексами та без (див. також рис. 1.28). У випадку, зображеному на рис. 5.11, кросинговер між двома дуплексами, що належать одній хромосомі, зумовить делецію - вирізання ділянки між локусом МАТ і касетою НМІа. Отже, у цьому разі спрямовано реалізуються лише такі варіанти розділення, які не приводять до кросинговеру та, відповідно, хромосомних аберацій.

Слід зауважити, що й при міжхроматидній гомологічній рекомбінації не завжди кросинговер і конверсія без кросинговеру є рівно- ймовірними подіями. Так, при рекомбінації під час мітозу диплоїдних клітин дріжджів кросинговер відбувається лише в 10 % рекомбінаційних подій. Таким чином, принаймні в деяких випадках, процеси гомологічної рекомбінації можуть здійснюватися саме з метою конверсії геномної ділянки, яка б не супроводжувалась кросинговером.

Касетний механізм перемикання активності генів є досить поширеним: аналогічні процеси описано для інших видів аскоміцетів, трипаносом і деяких бактерій. Крім того, такий механізм напевно реалізується при внутрішньохромосомній гомологічній рекомбінації на генах, що тандемно повторюються (за принципом, який ілюструє рис. 5.11, і без кросинговеру), з метою підтримувати ідентичність тандемних копій: мутація в одній з таких копій з високою імовірністю буде елімінована за рахунок використання іншої з багатьох нормальних гомологічних ділянок як матриці.

Повернемося до перемикання типів клітин у S. ceremsiae, яке є також добре вивченим прикладом взаємодії генів на рівні регуляції транскрипції. Приблизно по центру локусу МАТα розташована операторна ділянка, що активує два промотори, з яких відбувається транскрипція у двох протилежних напрямках. Продуктами цих генів є два білки α1 та α2 - транскрипційні фактори. Перший із них активує транскрипцію групи генів, які визначають специфічні ознаки клітин а-типу, другий - є репресором для групи α-специфічних генів (рис. 5.12). При цьому в гаплоїдних клітинах обох типів експресується група генів, специфічних для гаплоїдних клітин узагалі - за рахунок активації іншим фактором транскрипції. У клітинах а-типу з локусу МАТа експресується білок а1, який сам по собі не впливає на транскрипцію зазначених груп генів, але відсутність білків α1 і α2 зумовлює активацію а-специфічних (за відсутності репресора) і вимикання а-специфічних (за відсутності активатора) генів (рис. 5.12). У гетерозиготних за обома МАТ-локусами диплоїдних клітинах білок а1 утворює комплекс із α2, який ефективно блокує транскрипцію α1 (у результаті а-специфічні гени знову вимкнено), а також транскрипцію генів, специфічних для гаплоїдних клітин (рис. 5.12).

Крім того, комплекс а1-α2 є репресором гена НО, який не здатен ініціювати процес рекомбінації, зображений на рис. 5.11, у диплоїдних клітинах. Активація цього гена в гаплоїдних клітинах потребує набору певних активаторів транскрипції, поява яких узгоджена з регуляцією клітинного циклу: вони з'являються тільки на пізній G1-стадії, коли й може розпочатися перемикання типів клітин.

Рис. 5.12. Схема регуляції транскрипції в диплоїдних і гаплоїдних клітинах двох типів S. cerevisiae. Червоні стрілки - мРНК,

овали - відповідні білкові продукти, які є факторами транскрипції груп генів, котрі специфічно виявляються в гаплоїдних клітинах узагалі (hsg), a-клітинах (asg) та a-клітинах (asg)

Але регуляція активності гена НО є ще складнішою та не до кінця з'ясованою. Справа в тому, що після мітозу гаплоїдна спора продукує два типи клітин, які дещо розрізняються за властивостями, - так звані материнську та дочірню. Перемикання типів клітин відбувається тільки в материнській клітині, дочірня не здатна це робити, оскільки ген НО не активується. Отже, материнська клітина змінює свій тип - наприклад, a на α, і відбувається поділ з утворенням двох α-клітин, одна з яких знову є материнською і змінює свій тип на a, а інша - дочірньою, вона залишається клітиною α-типу.

Така асиметрія продуктів мітозу є характерною також для диференціації клітин багатоклітинних організмів, коли стовбурова клітина дає початок стовбуровій клітині та клітині, котра є більш спеціалізованою та такою, що втратила частину потенціалу розвитку. Розглянуті приклади відображають лише невелику частину вивчених для S. cerevisiaeгенетичних механізмів, які допомагають з'ясувати загальні закономірності функціонування еукаріотичного апарату спадковості.